山东大学微生物技术国家重点实验室佘群新教授团队的文章“Rational design of unrestricted pRN1 derivatives and their application in the construction of a dual plasmid vector system for Saccharolobus islandicus”已在mLife网站正式上线 。该研究团队发现，pRN1质粒携带一段可以被冰岛硫化叶菌（Saccharolobus islandicus）CRISPR系统靶向的序列，可以介导对该质粒的CRISPR免疫活性，导致基于该质粒的载体在冰岛硫化叶菌REY15A中不能稳定存在。通过理性设计逃逸CRISPR免疫的序列，最终获得了具有同义突变pRN1骨架且稳定的质粒载体。后续结果表明，基于pRN1和pRN2构建的载体单独或共转于古菌细胞中均能稳定存在，该研究为古菌遗传学分析提供了一个双质粒载体系统。

Saccharolobus islandicus REY15A是为数不多的具有一系列高效遗传工具的模式古菌之一，这些工具包括蛋白质表达系统、质粒干涉、基因沉默和高效的基于内源CRISPR系统的基因编辑体系。但是，迄今为止这些遗传工具体系都是基于pRN2质粒为骨架建立的。在古菌质粒载体开发利用的早期，冰岛硫化叶菌REN1H1中共存的pRN1和pRN2质粒均可被用于构建冰岛硫化叶菌REY15A的穿梭载体。研究发现，基于pRN2质粒的穿梭载体展示了较高的转化率，并稳定地存在于古菌宿主中，而基于pRN1质粒的穿梭载体转化只产生了很少的菌落，且质粒明显丢失。但是，pRN1质粒在冰岛硫化叶菌REY15A中不能稳定存在的机制尚不清楚。

由于CRISPR通常情况下介导病毒和质粒的免疫，该研究推测pRN1质粒的不稳定性可能是由于CRISPR免疫造成的。冰岛硫化叶菌REY15A基因组含有一个I-A和两个Ⅲ-B CRISPR系统，通过分析冰岛硫化叶菌REY15A中spacer所靶向的遗传元件，发现该菌株携带一个与pRN1序列高度匹配的spacer（L2S56），且该spacer与pRN1质粒中的复制酶基因编码序列仅有两个错配（Target N1）（图1），这可能是pRN1质粒不能稳定存在于该宿主的原因。随后通过质粒干涉以及protospacer突变实验证明L2S56在冰岛硫化叶菌REY15A中的表达能够引发I‐A CRISPR免疫，但不会引发III‐B系统的免疫。

图1 冰岛硫化叶菌REY15A的CRISPR-Cas系统对pRN1所携带的靶标DNA片段具有免疫能力是该古菌宿主限制pRN1质粒的分子基础

为了获得能够逃逸宿主CRISPR免疫的功能性Target N1衍生物，该团队基于pRN1靶标设计了三个突变的DNA片段（N1a、N1b和N1c），其中N1a中设计的突变是同义的，而N1b和N1c具有错义突变。结果表明，这三个突变靶点均逃逸了CRISPR系统靶向。随后的实验还表明N1c携带的错义突变可能使复制蛋白失活。

基于以上实验分析，该研究随后设计了包含有N1d同义突变的pRN1骨架、argD筛选标记、p15A复制起点和卡那霉素抗性筛选标记的大肠杆菌穿梭载体pN1dAA，该载体可与pRN2衍生质粒pSeSD在冰岛硫化叶菌REY15A中稳定共存（图2）。至此，该研究成功为冰岛硫化叶菌REY15A这一重要的古菌研究模式生物建立了双质粒遗传操作系统，为古菌遗传学研究提供了更加灵活的工具。

图2 Target N1突变设计及其逃逸冰岛硫化叶菌CRISPR免疫的能力验证

引用本论文：Zhao P, Bi X, Wang X, Feng X, Shen Y, Yuan G, et al. Rational design of unrestricted pRN1derivatives and their application in the construction of a dual plasmid vector system for Saccharolobus  islandicus. mLife. 2024.

原文链接：

https://doi.org/10.1002/mlf2.12107

第一作者

赵鹏鹏  博士

作者单位：山东大学微生物技术国家重点实验室

作者简介：博士在读，主要从事III型CRISPR系统信号通路免疫机制研究。

第一作者

毕晓楠  硕士

作者单位：山东大学微生物技术国家重点实验室

作者简介：2020级硕士，主要从事III型CRISPR信号通路免疫机制以及基于编辑SMVI病毒的遗传学分析。

通讯作者

袁冠华 

作者单位：山东大学微生物技术国家重点实验室

作者简介：博士，主要从事基因组大片段敲除技术开发以及冰岛硫化叶菌底盘细胞构建。

通讯作者

佘群新  教授

作者单位：山东大学微生物技术国家重点实验室

作者简介：山东大学特聘教授，国家杰出青年基金（国际合作）获得者，主要研究：古菌DNA损伤修复、细胞周期；原核生物与其病毒的防御与抗防御的分子机制。是国际上最早开展古菌遗传学和CRISPR生物学研究的科研人员之一。在Nature、Cell、Mol Cell、Cell Host Microbe等高水平期刊上发表了科研论文140余篇。

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