摘  要：介绍了基于贻贝粘蛋白、纤维蛋白原、胶原、明胶、多糖等天然生物质材料制得的医用生物粘合剂的粘结机理、应用现状以及存在的问题和发展前景。

关键词：生物质；医用粘合剂；贻贝粘蛋白；纤维蛋白；胶原

中图分类号：TQ431                 文献标识码：A

Biomass-basedTissue Adhesives and Their Application Status and Development Prospects

CUIGuo-lian, DAN Nian-hua, DAN Wei-hua, LAN Jie

(1.Key Laboratory of Leather Chemistry and Engineering of Ministry of Education, Sichuan University,Chengdu 610065, China;

2.The Center of BiomedicineEngineering of Sichuan University, Chengdu610065, China)

Abstract:The adhesive mechanism and application status of medical bioadhesives based onnatural biomass such as mussel adhesive protein, fibrinogen, collagen, gelatin,chitosan, alginate chondroitin sulfate, etc. are inrtoduced in this paper.Besides, the existing problems and development prospects of each kind of thoseadhesives are also analyzed and forecasted.

Key words:biomass; medical adhesive; mussel adhesive protein; fibrinogen; collagen

前言

      多年来，由于缝合牢固、伤口不易裂开等优点，采用缝合线、铆钉等材料或器械缝合伤口是临床上最常用且最有效的伤口粘合方法。然而，随着现代医学的快速发展，临床上对手术方法和辅助材料的要求越来越高，不仅要求最大限度地减少患者伤痛，缩短伤口愈合时间，而且要求在恢复功能的同时，外观也能完美地恢复。而传统的缝合方法缝合操作费时，屡次换药拆线增加病人痛苦，伤口处易感染、化脓，愈合后留有疤痕甚至干扰组织功能复原，使得医用粘合剂的研发十分必要。

       医用粘合剂是指能够在体内聚合，使组织间或组织与非组织间快速粘合，并能够起到一定的止血和密封作用的医用材料。按照材料性质不同可分为生物粘合剂（如纤维蛋白衍生物、贻贝粘附蛋白、明胶等）和化学粘合剂（如氰基丙烯酸酯类^[1]、聚乙二醇类^[2]、聚氨酯类等^[3]）。按照用途不同可分为软组织用粘合剂、牙科用粘合剂、骨科用粘合剂和皮肤用压敏胶，其中软组织粘合剂又可分为天然生物质粘合剂、半合成粘合剂和合成粘合剂等^[4]。理想的医用粘合剂应满足如下条件^[3]：（1）使用安全、无菌、无毒、具有良好的生物相容性，不妨碍人体组织的自身愈合；（2）在生理条件下能够快速地粘合组织，具有良好的粘合强度和持久性；（3）具有一定的止血和促进组织再生功能，并且能够抑制细菌感染；（4）在合理时间内可降解和被机体吸收，降解产物对机体无毒副作用；（5）使用方便，容易储存，价格低廉，原料易得。

由于化学粘合剂往往存在粘结部位弹性差、对活体组织产生异物反应以及潜在的化学毒性等缺点^[5]，而天然生物质材料大多具有良好的生物相容性和低免疫原性，因此，后者更加受到研究者的青睐。本文在查阅国内外文献资料的基础上，侧重对来源于生物质的医用粘合材料及其临床应用进行了综述，并对其发展前景进行了分析，提出了作者的一孔之见，以求抛砖引玉。

1贻贝粘附蛋白粘合剂

      贻贝是一种广泛存在于沿海和近海的海洋生物，其能够依靠足丝腺分泌物所形成的足丝盘将自身粘附在各种固体基材表面^[6]，具有极强的耐水性和耐候性，在巨浪的冲刷下仍能牢固地粘附在船底。研究表明，贻贝的这一性能与其分泌的足丝蛋白有关，足盘中含有多种蛋白质，具有优良的防水性能，无毒、可降解、生物相容性好，能够促进细胞的粘附和增殖^[7]，在湿润条件下高效粘合，符合组织粘合剂粘合和密封的要求，因此，近年来受到研究者的广泛关注^{[2, 8]}，被视为可以改变医用粘合剂历史的最具有潜力的蛋白，某些贻贝粘蛋白（MusselAdhesive Protein, MAP）已经成功用于细胞和组织的粘合甚至皮肤组织、粘膜组织、软组织、骨骼等创口和手术切口的粘合^[9]。

1.1 粘合机理

贻贝足盘中主要有6种粘性蛋白（Mussel footproteins, Mfp），简称Mfp1~Mfp6^[6,10]，这些蛋白质都包含一种酪氨酸衍生氨基酸L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-3,4-dihydroxyphenyalanine,DOPA)^[11]，而且通过对蛋白多肽分析发现，Mfp3和Mfp5主要分布于贻贝足盘与固体材料的接触面上，而且DOPA的含量高于其余四种蛋白的DOPA含量^{[12, 13]}。进一步研究发现，DOPA含量越高，粘蛋白的粘附能力越强，而且多巴胺（Dopamine）等含有儿茶酚结构的化合物与DOPA相似也具有较强的粘附能力^[14]。因此，有研究表明贻贝粘蛋白所具有的超强粘附特性与DOPA结构中的儿茶酚基团息息相关，该官能团具有化学多功能性和亲多样性^[12]，不仅容易与蛋白质形成氢键结合，而且具有很强的金属配位螯合能力，儿茶酚基团被氧化后能与很多基团反应形成共价键^[10,15]。在碱性条件和有氧存在下，DOPA的酚羟基能被氧化成醌或半醌，不仅能与氨基和巯基发生Michael加成和Schiff碱反应，而且能分子内环化形成脱氢吲哚结构，以及发生自身歧化反应形成自由基，发生偶联反应，最终与基材形成交联，增强与基材的粘附力和内聚力^[15,16]。但目前人们对贻贝粘附蛋白的具体作用机理尚不完全清楚，还有待进一步的研究。

1.2 临床应用

受贻贝在潮湿环境下具有超强粘附能力的启发，人们很早以前就对MAP进行研究，以期仿制成粘合剂用于组织粘合。1990年，BD Biosiences公司从紫贻贝中成功提取并开发成商业产品的Cell-Tak^TM，主要成分是Mfp-1和Mfp-2的混合物，以及瑞典BioScienceLaboratory提取的主要成分是Mfp-1的MAP^TM，都具有低细胞毒性和很好的粘附性能，是目前商业化应用的两种MAP，但其制备方法都非常低效，浪费资源，有报道称用10000个贻贝才能提取大约1g的MAP，并且价格昂贵，粘合牢度不够高，限制了临床上的推广应用，主要用作细胞和组织培养的粘合剂^[17-20]。目前全球仅有5家企业提取MAP产品出售，其中江阴贝瑞森生化技术有限公司是国内唯一一家，其产品USUNAfix已经进入多家医院进行基础和临床应用研究^[21]。纵使天然MAP产量很低，但人们对它的分子结构、组成和应用的研究从未停止，Ninan等^[22]将MAP提取物用于猪皮的粘附实验证明其粘附强度优于市售的两种氰基丙烯酸酯。近年来，通过基因重组等方法合成仿贻贝粘附多肽成为研究热点，Hwang等^[18]采用基因重组技术合成fp-151,即Mfp-5两端分别融合了3个Mfp-1十肽重复序列的蛋白，通过与Cell-Tak^TM相比，具有表达量高、纯化过程简单的优点，细胞粘附性和生物相容性均接近甚至超过Cell-Tak^TM，具有良好的应用前景。刘加鹏^[9]采用基因重组技术构建的Mcfp-1-12仿贻贝粘合剂同样具有较好的粘附性能和生物相容性。

天然MAP含量极低，直接从贻贝足丝中提取粘附蛋白既困难又成本高^[23]，而DOPA中的儿茶酚结构是粘附和交联的关键，因此，人们尝试用DOPA替代MAP，并且已有研究证明在线性或支化形聚合物中引入DOPA或Dopamine能够获得类似MAP的粘附能力^{[24, 25]}。DOPA与聚乙二醇^[2]、甲基丙烯酸乙二醇丙烯酸酯^[26]、透明质酸^[27]、壳聚糖^[28]等合成或天然材料的复合来提高材料的亲水性和细胞亲附率成为研究热点，不仅赋予材料更多的反应基团，而且提高了材料的粘结强度，但与理想的组织粘合剂粘合强度的要求仍有一定的差距。

1.3 存在问题及发展方向

受实验技术的制约，从贻贝直接提取的MAP用于组织粘合时粘合强度较弱，可能原因是MAP中DOPA的儿茶酚结构被氧化导致粘性下降、流变性降低，难以与不规则的固体表面紧密接触，从而降低了与固体材料之间的粘附力，又因为MAP的提取率极低，价格昂贵，不易保存等缺点限制了天然MAP提取物的应用推广。因此，人们开始尝试采用生物技术手段合成仿MAP粘合剂，但是由于对MAP空间结构和粘附机理的认识不足，已有的基因工程技术合成的MAP多肽仍无法达到贻贝的粘附效果。而天然MAP与其它合成材料交联制得的粘合剂虽说能增加材料的使用性能，但往往也会增大毒性。另外，据王贵学等^[12]报道，在高浓度低pH值情况下，以Mfp-1为主要成分的MAP会引起细胞团聚，具有较强的细胞毒性，但当稀释至一定程度、调节pH值接近生理条件时不具有细胞毒性。因此，人们尚需对MAP的各项性能进行研究，相信这并不会降低MAP用作医用组织粘合剂的潜力。

      未来对MAP的基础研究和人工合成类似粘蛋白仍将是研究重点。Dopamine已被证明同样具有很强的粘合性和良好的生物相容性^{[25,29, 30]}，利用DOPA或Dopamine通过接枝、共聚等方法接入大分子长链中，模拟足丝蛋白制备仿贻贝粘合剂已成为许多研究方法的核心。另外，仿MAP粘合剂还有望作为密封剂和药物控释载体用于临床。

2 纤维蛋白粘合剂

纤维蛋白粘合剂（fibrinsealant, FS）最早被用于伤口止血，直到1944年才首次被用于烧伤皮肤移植的粘合^[31]。然而，由于受当时分离技术的制约，FS并没有迅速地普及应用。直到1982年首个FS商品在欧洲上市后，才逐渐在临床上取得广泛应用。但直到1998年美国食品药品监督管理局（FDA）才批准一些FS产品用于临床手术，目前FS已广泛用于创口的止血、粘合、密封等方面。

2.1 主要成分及粘合机理

      FS成分是纤维蛋白原、活性溶液和抗纤溶剂，其中纤维蛋白原是主要成分，从血浆中提取，由三条肽链Aα₂、Bβ₂和γ₂构成；活性溶液包括凝血酶、Ca²⁺、Ⅷ因子，能够促使纤维蛋白原转化为纤维蛋白单体，进而自发聚集为无共价键相连的多聚体，Ca²⁺存在下被凝血酶激活的Ⅷ因子能催化2条γ链之间形成共价键，最终形成稳定、不溶、坚牢的纤维凝块，增强了FS的粘合强度^[32]；抗纤溶剂主要是抑肽酶，用以抑制纤维凝块的降解。而商品化的FS通常由两部分组成：一部分含有高浓度的纤维蛋白原和Ⅷ因子以及适量的抑肽酶和稳定剂，另一部分主要是凝血酶和CaCl₂^[5]。使用时将两部分在需要粘合的部位混合，Ca²⁺存在下凝血酶激活纤维蛋白原形成纤维蛋白凝块，可以牢固地粘合创口，起到止血、密封和促进组织愈合的目的。

2.2 临床应用

      FS来源于血浆，具有良好的生物相容性和生物可降解性，粘度低，特别适合凹凸不平的创口，组织亲和性好，既能粘合皮肤又可止血，因此已经成为临床上应用最多的伤口粘合剂。美国市场上已有多个产品如Tisseel、Artiss、Evicel、Vitagel等^[3]被美国FDA批准用于临床，其中Tisseel和Artiss能被用作止血剂、密封胶和粘合剂，二者主要成分均为纤维蛋白和人凝血酶，临床应用表明二者都能有效地对伤口止血、密封和粘合，并且不会导致机体免疫反应^[33]。Elvin等^[34]将光交联的纤维蛋白原用于兔皮肤修复实验，结果表明其能在20s内密封伤口，并且在伤口处有新的胶原纤维生成，伤口愈合较好。目前，FS在心血管手术止血、硬脑膜修复、封闭脑脊液泄露、疝气修补、肛瘘修复以及眼科、胸外科等手术上均有广泛的应用^[35,36]。

2.3 存在问题及发展方向

目前临床应用的FS产品大多是从人的血浆中提取制得，具有传染疾病的风险，并且人血浆来源少，成本高，价格昂贵，而异体来源的FS容易引起人体的免疫反应，同样具有传播病毒的风险，限制了临床推广应用^[36]。为了解决FS来源局限的问题，人们设法用重组技术来生产FS，Carlson等^[37]将转基因牛奶中提取的纤维蛋白原、酵母菌发酵产生的人Ⅷ因子以及动物细胞培养产生的人凝血酶制得的重组人纤维蛋白胶（rhFS）用于猪肝切除术，人血浆提取制得的FS作为对照，结果表明rhFS具有相同或更优的止血性能和粘结强度。但由于该方法成本高，技术复杂，还很少有企业去研制。另外，纤维蛋白原和凝血酶使用前要分别冷冻储藏，使用时首先解冻至常温，然后用双管注射器混合后使用，需要很长的准备时间。其粘结强度低，尤其在湿润条件下更低，目前只能与传统的缝合法并用提高粘结强度。

      未来FS的发展必须克服原料来源少、价格高、粘合强度不足以及携带病毒风险等缺点。加入一些支架材料如胶原来提高FS的弹性和机械强度也有助于提高产品的使用性能。尽管FS产品在欧洲已经有几十年的应用历史，并且很少发现使用后产生不良反应的报道，美国FDA也批准了个别产品上市，但是FS产品很可能在找到一种合适的替代粘合剂后被淘汰。不过，未来一段时间内，FS产品仍将是使用最广的手术粘合剂之一。

3 胶原及明胶基粘合剂

3.1 胶原基粘合剂

胶原约占哺乳动物体内总蛋白含量的1/3，具有独特的生物活性、良好的生物相容性，易降解，能促进创口愈合，已被广泛用于美容化妆、止血、创伤修复、构建组织器官和药物缓释等方面，但是其用作组织粘合剂的报道比较少。FloSeal和Proceed是美国批准应用的两种胶原基粘合剂，都是由牛胶原和牛凝血酶复合而成，通过提供凝结基质促进纤维蛋白原凝结，分别被用于血管手术止血和治疗脑脊液泄露^[38]。另外一种胶原基产品CoStasis在上述两种成分的基础上增加了人的血浆，显著增加了止血性能。但这类粘合剂的缺点是需要大约10min的时间才能产生充分的粘合强度^[36]。Baik等^[39]采用去端肽胶原与一定比例的CaCl₂、DOPA、凝血酸或氨基乙酸复合制得BleestopA和Bleestop B止血粘合剂用于大鼠实验，结果表明BleestopA可以在30s内完成止血和局部粘合，95%的切口在1min内实现粘附，而使用Bleestop B时95%的切口在45s内实现粘附，尽管二者的粘合时间和强度稍弱于血浆制品TissucolDue Quick粘合剂，而且前1min粘合强度弱于FS，但其安全性却优于后者，值得进一步研究。

3.2 明胶基粘合剂

作为胶原的降解产物，明胶同样具有良好的生物相容性和可降解性，能形成透明、柔韧、高强度的胶，然而由于其在水中可溶导致结构不稳定，因此，常常对明胶进行交联改性以便在生理条件下使用。明胶的氨基与醛基发生缩合反应后可降低明胶的水溶性，又能增加粘合强度，因此，早在上世纪60年代人们就制得明胶-间苯二酚-甲醛（GRF）止血剂用于胃肠术和泌尿术，自从1977年Bachet等^[40]将GRF胶作为粘合剂和止血剂用于主动脉修复并取得成功后，GRF开始作为粘合剂用于临床。但由于甲醛毒性较大，人们便引用毒性相对较小的戊二醛制得明胶-间苯二酚-甲醛-戊二醛（GRFG）胶，可以与组织在30s内形成交联^[41]，具有很大的粘合强度。GRFG胶由两部分组成，分别为明胶-间苯二酚溶液和甲醛-戊二醛溶液，甲醛、戊二醛不仅能与明胶和组织中的氨基发生醛胺缩合反应，而且也与间苯二酚发生亲电加成反应，形成很强的粘合牢度。尽管过去几十年GRF/GRFG胶在欧洲和日本均有较好的临床应用，但是由于其体内降解性差^[4]以及残留的甲醛和戊二醛可能致癌，有研究者开始寻找少用或不用醛的交联技术如光交联、自由基光引发技术^[3]实现明胶的交联。Elvin等^[42]采用光化学交联制得的明胶基粘合剂具有很高的粘合强度（>100kPa）、弹性和抗张强度，并且具有良好的生物相容性和组织修复功能。Matsuda等^[43]采用二琥珀酒石酸（disuccinimidyltartrate, DST）与明胶和组织中的氨基反应实现粘合。还有研究者将微生物谷氨酰胺转胺酶（microbialtransglutaminase，mTG）与明胶交联制得gelatin-mTG胶，能够与湿润的组织形成交联，粘结强度大于FS^[44]，体内实验证明gelatin-mTG胶能够在5min内与组织粘结，并且具有止血功能，但它的生物相容和降解性尚未评价^[45]。

3.3 胶原及明胶基粘合剂发展前景

      尽管胶原用作组织粘合剂的报道还比较少，但已有的一些研究证明了其具有很大的潜力。胶原的引入会提高粘合剂的生物相容性和可降解性，甚至赋予材料止血、修复、药物缓释的功能，因此，未来基于胶原的粘合剂将会进一步发展。而明胶基粘合剂也是一类重要的生物粘合剂，粘合强度高，但往往会与其它材料复合使用，导致材料的生物相容性、可降解性和使用安全性受到影响，需要进一步优化。但鉴于明胶优良的性能，未来人们有望开发出更多的基于明胶的粘合剂。

4 多糖类粘合剂

4.1 壳聚糖基粘合剂

      壳聚糖是由自然界广泛存在的甲壳素经过脱乙酰作用得到的氨基多糖，具有优良的生物相容性和生物可降解性以及止血、抗菌功能，已作为止血敷料用于临床，Hem Con^TM就是一种被美国FDA批准上市的止血剂^[46]。壳聚糖与组织或粘液间的离子键作用赋予其粘附性能^[47]，同样可以作为一种组织粘合材料。但由于壳聚糖含有大量的-NH₂，在生理条件下带正电荷，单独使用时与组织的粘附力差，因此，目前研究最多的是将壳聚糖改性或与其它材料复合制作粘合剂，如Nie等^[48]将硫醇化的壳聚糖和马来酰亚胺改性的ε-聚赖氨酸交联制得的水凝胶能够在15~215s内形成胶凝，粘附强度是市售纤维蛋白胶的4倍，并且对L929细胞几乎没有毒性，但尚需要进一步的临床试验。Amoozgar等^[49]将对叠氮苯甲酸改性的壳聚糖经光交联后与聚乙二醇复混制得粘合剂用于神经吻合术发现其比纤维蛋白胶具有更大的黏性模量、更短的胶粘时间，一系列的体内和体外细胞实验也证明该粘合剂具有良好的组织相容性。近年来，采用红外或紫外激光制备壳聚糖基粘合剂的技术也有报道^[50]，但是该技术具有诱发基因突变的风险。

4.2 海藻酸盐

      海藻酸是从海带或马尾藻中提取碘和甘露醇后的天然多糖，用碱中和后得到海藻酸盐，不仅是一种天然的粘度调节剂而且是一种能提供大量羧基反应位点的天然生物材料。郑江等^[51]比较了海藻酸钠、瓜尔胶和羧甲基纤维素钠作为骨粘合剂粘合断骨的强度，结果发现瓜尔胶的粘合强度最大，海藻酸钠次之，羧甲基纤维素钠最小。但是单独的海藻酸盐的粘合强度与目前临床应用的粘合剂还有一定的差距。为了增强粘合效果，Bitton等^[52]受褐藻能粘附在海底岩石上的启发，采用间苯三酚替代褐藻多酚，并与海藻酸盐、Ca²⁺复合制得了一种新型粘合剂，与猪组织的粘合力达到17-25kPa，有望用作软组织粘合剂。另外，也有将海藻酸钠与明胶复合制作生物粘合剂的报道^[53]。

4.3 硫酸软骨素

      硫酸软骨素是一类硫酸化的糖胺聚糖，主要分布于人和动物的软骨等结蹄组织中，具有抗炎、调节免疫、调节细胞粘附、保护心脑血管以及抗肿瘤等作用^[54]。和壳聚糖、海藻酸盐一样，硫酸软骨素单独作为组织粘合剂的研究较少，已有的研究中大多是将其与聚乙二醇^[55]、醛类^[56]、琥珀酰亚胺^[57]、甲基丙烯酸酯^[58]等交联后用作组织粘合剂，但引入一些化合物后材料的细胞毒性会变大，不利于临床推广应用。

4.4 多糖类粘合剂的发展前景

      壳聚糖、海藻酸盐和硫酸软骨素都是重要的天然生物质材料，来源广泛，功能多样，在生物医学领域均有广泛的应用。与FS相比，不具有传播疾病的风险，而且都具有合成组织粘合剂的条件，所制得的粘合剂除了具有粘合功能外，还会具有各自的其它功能，但是三者单独使用时的粘合强度有限，均需要与其它材料交联复合使用，这也是多糖类粘合剂的发展趋势。

5 其它生物粘合剂

      已经在临床上推广应用的WAB组织粘合剂是一种高纯度生物酶制剂，主要成分为蛋白质和多肽，粘合机理是酶与底物组织的凝集反应，使用安全、无毒、易降解^[59]，但是缺点是粘合力不足，只能门诊处理小伤口。

另外，除了MAP之外，人们对藤壶^[60]、有孔虫和沙塔蠕虫^[61]分泌物所具有的特殊粘附性能同样产生了巨大的兴趣，这些天然生物胶黏剂将有助于启发人们开发出新型的仿生粘合剂。

6 结束语

      基于MAP的粘合剂和FS一样，都具有优良的粘附性能，但是二者原料来源均不足，价格昂贵，限制了推广应用，随着蛋白质工程和基因工程的发展，未来人们有望借助现代生物技术解决原料来源问题。胶原、明胶和多糖均可作为医用粘合剂原料，但是大多需要与其它一些天然或合成的材料接枝或共聚提高粘合强度等性能。总之，MAP、FS、胶原、明胶以及多糖等已成为医用粘合剂研发中使用最广的天然生物质材料，尤其是仿MAP粘合剂已成为研究的热点，研究仿生粘合剂是一个正在迅速扩大的领域，如用Dopamine替代MAP来开发粘合剂等。而将一种或多种上述生物质材料通过接枝、共聚等技术与人工合成材料复合构建医用粘合剂也将是今后一段时间研究的重点。兼具止血、药物缓释、伤口修复等多功能的粘合剂也会受到研究者的关注。随着科学技术的发展，相信不久的将来，人们一定会研制出理想的组织粘合剂来替代传统的手术伤口缝合方式。

注：本文已经发表于2015年10月。