撰稿人：张李栋（陆军军医大学）

精读文献标题：Deep Multilayer Brain Proteomics Identifies Molecular Networks in Alzheimer’s Disease Progression（深层多层次脑蛋白质组学揭示阿尔茨海默病的分子网络）

发表时间：2020年5月18日

发表期刊：Neuron

影响因子：14.415

作者及单位：美国田纳西州圣裘德儿童研究医院彭隽敏教授团队

主要结论：确定了阿尔茨海默病发病进程中的蛋白质分子网络，筛选了15个β-淀粉样蛋白（Aβ）相关的蛋白，证实淀粉样病理斑块的出现与一些Aβ相关蛋白相关。

文献精读

阿尔茨海默病（AD）是最常见的痴呆症类型，给患者和医疗系统带来了沉重的负担。但是，传统治疗策略一直未能缓解AD所带来的认知能力下降问题。随着新一代DNA、RNA和蛋白质测序技术的发展，阐明AD疾病的蛋白分子网络以及发现新的治疗靶点成为可能。AD的转录组分析已经构建了潜在的疾病网络，并可用于识别出AD中细胞类型的特异性改变。然而，在复杂的脑组织中，转录组常常不是蛋白质丰度的准确指标，蛋白质组学技术的发展促使我们重新审视AD发展过程中整个蛋白分子网络的变化。

近日，来自美国田纳西州圣裘德儿童研究医院的彭隽敏教授团队在国际期刊Neuron（IF=14.415）上发表了关于AD发病过程中蛋白分子网络变化的重要研究成果。研究人员利用TMT-LC/LC-MS/MS法分析了人类大脑中的14,513个蛋白和34,173个磷光体，揭示了17条通路中173个蛋白的变化，描述了AD进展阶段相关的蛋白分子网络变化。通过脑组织和脑脊髓液蛋白组学的分析比较，结合5xFAD小鼠样本，确定了15个β-淀粉样蛋白（Aβ）相关的蛋白（如MDK, NTN1, SMOC1, SLIT2和HTRA1），证实了淀粉样病理斑块的出现与一些Aβ相关蛋白相关。此研究为进一步解析AD疾病的致病机理，发现新的AD治疗靶点提供了重要的实验证据。

1、AD进展中的蛋白质组学和磷酸化组学研究策略

研究者首先收集了90个高质量的人类病例额叶皮层样本，分成LPC组、HPC组、MCI组、AD组、PSP组五组（样本策略），运用TMT-LC/LC-MS/MS技术（质谱策略）进行了分析，在AD疾病发展的不同阶段共鉴定到14,513个蛋白和34,173个磷酸化位点。

结果表明，检测到的Aβ肽水平与斑块病理结果保持一致，同时发现了三个全蛋白簇（WPCs）：WPC1如Aβ、CLU在HPC和MCI中早期增加，AD中持续积累；WPC2如MAPT、C1R在HPC和MCI中稳定，AD中显著增加；WPC3如BDNF、VGF，在HPC和MCI中保持不变，AD中明显下降。

同时，将AD蛋白质组学数据与报道的转录组学数据比较，发现58个AD改变蛋白中几乎所有降低蛋白都与RNA转录降低相关，但有55%的升高蛋白与转录上调相关，提示其余45%的升高蛋白受转录后机制的调控。通过对脑脊液样本进行了深度蛋白组学分析，发现4个新的候选生物标志物（SLC39A12, SLC5A3, SLIT2, STEAP3)。

图1 蛋白质组学和磷酸化组学研究策略及蛋白质组学数据的功能分析

二、AD中磷酸化蛋白质组功能及激酶预测

通过磷酸化蛋白组学分析，发现AD组中磷酸化Tau蛋白最高（图2A）；研究者在7,083个磷酸化蛋白上鉴定出34,173个磷酸位点包括25,698个pS，7,216个pT，1,259个pY位点（图2B），并通过聚类分析验证了可重复性（图2C）。

之后将873个DE磷酸肽（398个蛋白）分为四个磷酸肽簇（PPC1-PPC4)：PPC1在AD发展过程中呈稳定增长趋势；PPC2在HPC和MCI样本中稳定，在AD中显著增加；PPC3在HPC和MCI中轻微升高，而AD中降低；PPC4在HPC和MCI中磷酸化水平下调，在AD中磷酸化水平恢复；揭示了AD疾病进展过程中蛋白磷酸化的高度动态变化（图2D）。

通过对比PPC模式中富集的磷酸化蛋白通路，揭示了AD中剪接功能障碍和钙离子假说的两条新途径。在磷酸化蛋白组和全蛋白组之间只有11个蛋白重叠，表明磷酸化蛋白质组分析是一个新的分子调控层。之后基于IKAP机器学习算法推断出了186个激酶的活性，其中在AD中有28个发生了变化（图2F-H）。

图2 AD中蛋白磷酸化组学数据的功能分析及激酶预测

三、人类和小鼠中Aβ相关蛋白的改变

为了探索Aβ相关蛋白的积累诱导的分子事件，研究者鉴定了28个来自Banner Sun和Mount Sinai队列研究的与Aβ相关的DE蛋白，揭示了Aβ蛋白水平与脑组织的斑块病理有良好的相关性（图3A-C）。然后，在5xFAD模型中评估了Aβ相关蛋白的因果关系，通过分析5xFAD和野生型小鼠皮层中的16,128个蛋白（所有样本中有11573个蛋白；图3D-E），发现5xFAD小鼠中大多数Aβ相关蛋白受转录后机制调控。之后将小鼠的蛋白质组（5xFAD/WT）与人群组进行比较（HPC/LPC, MCI/LPC, AD/LPC），发现 5xFAD的蛋白质组结构最接近人类AD的晚期。

图3 AD和5xFAD小鼠模型中的Aβ相关蛋白

四、AD淀粉样斑块病理的相关发病机制

通过对7个数据集基因组数据和基因表达信息的整合，研究者发现了与AD发病机制有关的16条通路，揭示了高度排列的Aβ相关蛋白（如MDK, NTN1, SMOC1和ICAM1）与淀粉样斑块病理相关（图4）。

图4 AD和5xFAD中的选择性蛋白靶点的鉴定

综上所述，本研究利用TMT-LC/LC-MS/MS技术分析了AD发病进程中的14,513个蛋白和34,173个磷酸化位点。通过对AD患者进行遗传学分析和生化研究，研究者发现了3个致病基因（APP, PSEN1和PSEN2）、若干危险基因（APOE, TREM2和UNC5C）以及20多个低风险基因位点，同时表明了AD脑中的两个病理学特征：β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块和Tau神经纤维缠结。研究揭示了AD的关键分子网络和通路，发现了潜在的脑脊液生物标志物，并为解释小鼠模型和临床试验之间的转化差异提供了证据，为我们阐明AD疾病的蛋白分子网络和探索AD疾病新的治疗靶点提供了重要指导意义。

参考文献：

Bai B, Wang X, Li Y, et al. Deep Multilayer Brain Proteomics Identifies Molecular Networks in Alzheimer's Disease Progression. Neuron.

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