Nitrate–NRT1.1B–SPX4调控植物的氮磷信号网络

名称：Nitrate–NRT1.1B–SPX4 cascade integrates nitrogen and phosphorus signalling networks in plants

期刊：Nature Plants

作者及单位：胡斌…储成才研究员（中科院遗传与发育研究所）

DOI：10.1038/s41477-019-0384-1

研究背景

氮磷是植物需求最多的两种矿质营养素，也是农业生产利用最多的肥料。研究表明，不同的N/P供应比影响NP的吸收，高氮磷比可以有效促进P的吸收，但其分子机理尚未可知。氮磷信号之间是否存在互作？有，又是如何整合氮磷信号的呢？

研究结果

1、  硝酸盐通过激活磷信号途径协调氮磷利用率

低硝酸盐状态下，高磷酸盐供应不影响水稻生长和生物量，磷饥饿诱导基因(phosphate starvation-induced genes，PSIs)受到抑制。高硝酸盐状态下促进水稻生长和生物量增加，磷酸盐吸收增强，磷酸转运基因(phosphate transporter genes , PTs)和PSIs表达升高。且短期硝酸盐可以诱导PTs和PSIs的表达，表明硝酸盐可以直接激活磷饥饿信号，协调N-P平衡，促进生长。

a.中花11在不同NP状态下的生长表现；b.不同NP状态下的中花11的生物量；c.不同NP状态下Pi摄取活性；d. PSIs的硝酸盐诱导实验

2、  硝酸盐引发磷信号需要NRT1.1B

nrt1.1b突变体的PSIs不受硝酸盐诱导，而NRT1.1B-OE株系中，P含量和PSIs表达量上升，表明NRT1.1B的功能缺失影响硝酸盐引发的磷信号。长期培养时，高硝酸盐条件下供应高磷酸盐并不能显著促进生物量的累计；高磷酸盐高硝酸盐条件下nrt1.1b突变体的生长迟缓更显著。田间实验表明，nrt1.1b突变体叶鞘、叶片和茎中的硝酸盐含量显著下降。这些表明硝酸盐激活的磷酸盐响应依赖于NRT1.1B。

a. WT和nrt1.1b突变体根中磷酸盐响应基因的硝酸盐诱导实验；WT和nrt1.1b突变体在不同NP条件下的生长表现(b)和生物量(c)；

3、  硝酸盐通过SPX4-PHR2诱导PSIs的表达

硝酸盐不诱导SPX4基因的转录，但使蛋白积累减少，且蛋白降解过程受MG132（26S蛋白酶抑制剂）的抑制，暗示蛋白时发生了泛素化降解。此外，硝酸盐促进PHR2蛋白定位从细胞质向细胞核中转移。SPX4-OE和phr2突变体中，硝酸盐诱导的磷酸盐信号和PSIs基因受到抑制，表明SPX4-PHR2介导硝酸盐诱导的磷酸盐信号.

a.        WT根中SPX4的硝酸盐诱导实验; b.水稻原生质体中硝酸盐处理后eGFP-SPX4的荧光信号；c. SPX4–FLAG- OE株系中硝酸盐处理后根SPX4–FLAG 蛋白水平；d. 水稻原生质体中硝酸盐处理后eGFP-PHR2的亚细胞定位；e. 水稻原生质体中共转SPX4硝酸盐处理后eGFP-PHR2定位的影响

4、  NRT1.1B介导硝酸盐引发的SPX4降解，且硝酸盐促进NRT1.1B-SPX4互作

共表达NRT1.1B可以降低eGFP-SPX4的荧光强度，eGFP-SPX4蛋白显著降低，且蛋白降解过程受MG132抑制；nrt1.1b/SPX4-RNAi株系中PSIs表达上调。表明NRT1.1B部分介导SPX4的降解。

体内体外NRT1.1B-SPX4互作验证实验（pull-down，co-IP，LCI）表明NRT1.1B与SPX4互作，且硝酸盐可以增强互作；NRT1.1B的His356位点突变株系中，NRT1.1B-SPX4互作受阻。这表明NRT1.1B-SPX4存在物理互作，且互作受硝酸盐的获取影响。

a. NRT1.1B对eGFP-SPX4荧光强度的影响 b. 共表达MYC–NRT1.1B对eGFP-SPX4蛋白积累的影响 c. 硝酸盐诱导后WT和nrt1.1b突变体中SPX4–LUC的相对活性 d. 硝酸盐诱导后WT, nrt1.1b和nrt1.1b/SPX4-RNAi (Ri)根中磷酸盐响应基因的表达量 e. 有/无硝酸盐时GST–SPX4与NRT1.1B–eGFP-OE细胞裂解物的Pull-down实验 f. NRT1.1B-eGFP和 SPX4-FLAG的Co-IP实验 g. SPX4–nLUC和 cLUC–NRT1.1B的LCI实验 h. SPX4–nLUC和cLUC–NRT1.1B / cLUC–NRT1.1B^H362A的LCI实验

5、  SPX4通过调节NLP3的质-核转移参与硝酸盐信号途径

 OsNLP3是AtNLP7的直系同源基因，其核定位受硝酸盐调控，nlp3突变体中硝酸盐响应基因诱导受阻，表明NLP3参与硝酸盐信号。LCI和co-IP表明SPX4与NLP3互作，共表达SPX4抑制NLP3的质-核转移，OE-SPX4中硝酸盐响应基因表达受到抑制。SPX4-OE与nlp3突变体的N摄取能力降低。这些表明SPX4通过NRT1.1B参与硝酸盐信号，并通过硝酸盐信号转导途径中的NLP3激活下游硝酸盐响应基因。

a. SPX4–nLUC 和cLUC–NLP3的LCI实验b.  eGFP–SPX4 和NLP3–FLAG 的Co-IP实验  c. 硝酸盐诱导后SPX4 对 eGFP–NLP3亚细胞定位的影响 d. WT和SPX4-OE根中硝酸盐响应基因的硝酸盐诱导实验e. 有/无NRT1.1B条件下，硝酸盐对SPX4–NLP3互作的影响

6、  NRT1.1B招募E3泛素连接酶介导 SPX4降解

利用IP-MS鉴定到NRT1.1B结合蛋白1（NBIP1），是定位在质膜的E3泛素连接酶，其表达模式与NRT1.1B和SPX4相似。NBIP1的表达受低磷和高硝酸盐处理诱导，NBIP1-OE中PSIs和硝酸盐诱导基因表达均上调，磷酸盐含量显著提高，表现出磷酸盐中毒性状（spx4也有）。Co-IP实验表明，NRT1.1B、NBIP1 和SPX4在体外可以形成复合体，无NRT1.1B时，NBIP1 和SPX4存在微弱的互作。体外泛素化实验表明，NBIP1具有E3泛素化连接酶活性，且能显著减少WT中eGFP-SPX4蛋白的积累，而nrt1.1b突变体中该过程受到抑制。表明硝酸盐存在时，NRT1.1B招募NBIP1泛素化降解SPX4。

NRT1.1B–NBIP1–SPX4分子模块整合了硝酸盐和磷酸盐信号网络，包括硝酸盐获取(NRT1.1B)，信号转导(NRT1.1B–NBIP1–SPX4–PHR2/NLP3)及硝酸盐/硝酸盐响应(硝酸盐/磷酸盐响应基因的表达调控)。

a. NBIP1–eGFP的亚细胞定位b.  无硝酸盐时，WT 和NBIP1-OE根中硝酸盐/磷酸盐响应基因的表达  c. eGFP–SPX4、NBIP1–FLAG 和MYC–NRT1.1B的co-IP验证 d. 体外跨膜结构域截断NBIP1的自泛素化实验 e.  NBIP1^T 对GST–SPX4泛素化作用的体外检测  f. 共表达NBIP1–FLAG时， eGFP–SPX4的蛋白水平。

总结

建立了磷酸盐和硝酸盐的互作网络。硝酸盐信号首先被NRT1.1B感知，接着加强NRT1.1B，SPX4和NBIP1三者之间的互作，加快SPX4的泛素化降解，促进PHR2和NLP3的质核转移激活硝酸盐和磷酸盐的响应基因，最终实验N-P平衡。

？：

1、  聚合NRT1.1B^indica和spx4是否能进一步提高水稻产量和N\P的利用率？

2、  P和氨态氮信号之间是否也具有相似的联系？

3、  除了SPX4之外，是否还有NP网络枢纽？

希望大家可以指出错误的地方，提更多的问题或者解答问题，谢谢！