CRISPR/Cas 植物基因组编辑技术研究进展

杂志：华南农业大学学报

通讯作者：刘耀光

一．CRISPR/Cas9系统的发展历程

1987年 日本研究团队 在大肠埃希菌 Escherichia coli中发现了串联重复序列

Mojica等     在20多种微生物中发现了类似的重复序列，命名为SRSRs，并总结了它的基本特征。

2002年 Jansen 与 Mojica 更名为成簇的间隔短回文重复序（CRISPR）

鉴定出不用原核生物中高度相似的4个crispr关联基因

2005年 Mojica等 发现CRISPR基因座中存储了病原菌的基因信息，可能是微生物适应性免疫系统的一部分。

2007年 Barrangou等 证明了细菌通过识别与噬菌体序列相同的crispr间隔区对应的特定序列，获得抗性。

确认Cas7帮助细菌获得新的间隔序列和重复，Cas9发挥合算切割切割酶的作用

随后的几年，CRISPR细菌免疫系统的必要条件和作用机制相机被发现和证实。

2012年   Jinek等  crRNA与tracrRNA配对结合形成双分子RNA结构，介导Cas9蛋白定向切割DNA序列

2013年   张锋等  利用CRISPR/Cas9在人类和小鼠总实现了精准的基因编辑，并构建了可同时靶向多个位点的基因编辑系统。】

二．CRISPR/Cas系统的结构

CRISPR/Cas=CRISPR基因座+Cas基因

             ||

 富含AT碱基的前导序列Leader+涵盖回文序列的重复序列Repeater+从外源捕获的间隔序列Speacer

三．CRISPR/Cas系统的类型

一．CRISPR/Cas9系统的建立

1. 简化系统：保留tracrRNA和crRNA的核心序列，引入连接区，将两者合并为sgRNA。并证实Cas9能在sgRNA引导下切割双链RNA。

2. 最先被利用的SpCas9蛋白（来源于链球菌的Cas9蛋白）=RuvC-like结构域+HNH核酸酶

3. 在真核系统中，Cas9蛋白应添加一段核定位信号以保证该蛋白进入细胞核正常发挥功能。

4. sgRNA 是一段具有特定结构的单链 RNA，其 5＇端约 20 个碱基与靶 DNA 互补配对结合，引导 Cas9/ sgRNA 复合物对相应位点进行切割，决定编辑位点特异性。→只需改变sgRNA的5’端的特异位点识别序列→构建多个sgRNA表达盒的串联载体，可实现同时对多靶点的进行编辑。

5. 转化方法（植物系统中）：原生质体PEG转染、农杆菌叶片注射法、基因枪轰击、农杆菌介导转化等

6. 与CRISPR/Cas12a的比较

7. CRISPR/Cas12a系统的优势

（1）其crRNA比sgRNA更短，且Cas12a蛋白比Cas9蛋白更小→适用于装载量更小的载体系统，特别是多靶点编辑的情况。

（2）黏性末端，增加了HDR修复途径发生的概率，有利于DNA片段的定点插入和替换。

（3）在多个物种的基因编辑中，其脱靶率更低。

二．CRISPR/Cas9在植物基因组编辑中的应用

1. 功能基因的敲除

原理：Cas9蛋白切割目标DNA形成双链断裂→NHEJ易错修复途径

→Indel

1. 基因（片段）的定点插入或替换

原理：Cas9蛋白切割目标DNA形成双链断裂—^{引入供体片段}→HR修复途径—^同源重组→供体片段的精确插入或替换

优势：可实现多个控制优良性状基因的稳定聚合，解决传统育种中优良形状无法连锁遗传的问题

局限性：插入抗性基因，依赖于采用筛选剂富集编辑细胞，编辑效率低

技术改良

1. 单碱基编辑

CBE=胞嘧啶脱氨酶+nCas9—^sgRNA→非靶标链：C→U（靶点PAM序列上游5~12nt）             →靶标链：被切割，G→A

ABE=腺苷脱氨酶+nCas9

2. 基因的表达调控

用Cas9蛋白对目标基因的启动子区的CRE进行编辑或直接删除→随机性高，未必能获得理想性状

            dCas9蛋白+转录调控结构域—^sgRNA→抑制或激活目标基因的表达

   dCas9蛋白+乙酰转氨酶等蛋白→表观遗传编辑（植物中报道较少）

（dCas9蛋白：人工突变后失去核酸酶活性，仍保留DNA结合能力）

一．CRISPR基因编辑靶点的分析技术

1. 基于Sanger测序的靶点分析技术

（1）经典的解码方法：

构建克隆，并挑取多个克隆进行Sanger测序

利用特异引物           纯合突变株可与野生型和突变株序列对比获知

直接将PCR产物测序

                     双等位突变和杂合突变，测序峰图会出现双峰

（2）简并序列解码DSD

2. 基于高通量测序的靶点分析技术

3. 基于非测序手段的靶点分析技术

一．基因编辑技术的脱靶风险评估

1. 脱靶效应：在基因编辑过程中，CRISPR系统对非靶标位点进行非特异编辑从而导致不可控的基因组变异。

2. 脱靶情况的出现与靶序列的特异性有关

3. Cas蛋白介导的NEHJ途径的编辑具有较高的特异性→解决途径

4. ABE相比于CBE有较高的编辑特异性→解决途径

二．展望

二代测序+基因编辑技术→研究植物基因功能

郭东灵于2020年2月8日学习记录