通过氮响应的染色质调节提高绿色革命水稻品种产量

标题：Enhanced sustainable green revolution yield via nitrogen-responsive chromatin modulation in rice

期刊：Science（7 February 2020）

第一作者：吴昆 博士、 王栓锁 博士

通讯作者：傅向东 研究院

通讯地址：中科院遗传与发育研究所

DOI：10.1126/science.aaz2046

一．研究背景

上世纪60年代，以矮化育种为特征的“绿色革命”解决了因大量施肥导致的植株倒伏和减产问题，大幅度提升了水稻和小麦产量。经过40多年的探索和研究，人们逐渐从分子水平认识到“绿色革命”品种与赤霉素信号转导相关。水稻sd1和小麦Rht-1等位基因会促进抑制植株生长的DELLA蛋白的积累，造成了植物的矮化，抗倒伏能力显著提高，大大促进了作物产量的提高。正常条件下，GA促进DELLAs的降解，促进植株生长。绿色革命水稻品种（GRVs）为了获得高产，需要高氮肥供应，而这与可持续发展的理念相违背。水稻产量主要由每株分蘖数、每穗粒数和千粒重决定，在高密植条件下提高分蘖能力有助于GRVs的高产，因此低氮条件下提高水稻分蘖数成为了未来农业可持续发展的一大目标。

该文章聚焦于探索氮肥如何影响赤霉素信号来调节水稻分蘖数。

二．生物学意义

该发现不仅深化了对赤霉素信号传导和植物氮素响应相互作用机制的理解，而且找到了一条在保证产量提高的同时，降低化肥投入、减少环境污染的育种新策略，为培育“少投入、多产出、保护环境”的绿色高产高效新品种奠定了理论基础，并提供了有育种应用价值的基因资源。

三．主要结果

1. 氮通过NGR5促进水稻分蘖

（1）NJ6/NJ6-sd1，Rht-B1a/Rht-B1b在不同N供应条件下分蘖数、每穗粒数和千粒重的变化→氮增加，三者都会增长；且NJ6-sd1的分蘖数的增长强于NJ6，Rht-B1b>Rht-B1a→增强DELLA蛋白的功能可以促进N促进分蘖

（2）对GRV 9311施用外源赤霉素（GA3）或过表达GID1，分蘖数减少，且低N/高N下变化不明显。→GA-GID1抑制N促进分蘖

（3）显微镜下观察9311→N促进分蘖不是因为促进侧芽数量的增加，而是通过增加原始枝和分蘖枝的延伸来增加芽数

（4）9311/ngr/ngr5 pNGR5::NGR5→ngr5分蘖数减少，且对N不敏感；

（5）【图位克隆技术】→NGR5编码一个AP2结构域转录因子

（6）【遗传互补实验】9311/ngr/ngr5 pNGR5::ngr5 ；ngr5不能弥补其性状；NGR5对分蘖数、圆锥花序分枝数、粒数都有促进作用

（7）9311/ngr5在一系列N下→ngr5中N不表现对分蘖的促进

显微镜下观察ngr5分蘖芽的数量无影响，但原始枝和分蘖枝的芽数减少     →→N通过NGR5促进分蘖

（8）ngr5中，N增加，NGR5的mRNA和蛋白质含量都不增加

9311 p35S::NGR5-HA中，N增加，NGR-HA的蛋白质增加，mRNA不影响→N通过促进NGR5的丰度，促进分蘖

（9）9311+ngr5分蘖数减少→NGR5对于DELLA蛋促进分蘖是必要的

2. NGR5抑制分蘖抑制基因的表达

（1）【RNA-seq】ngr5中导致全基因组的mRNA发生变化，多种差异表达基因的mRNA含量增加。

（2）【基因富集反应】表达上升基因和H3K27me3型组蛋白甲基化标记基因正相关→NGR5可能参与PRC2复合体介导的表观抑制

（3）已知的表达上升基因中有大量分枝抑制基因，如D14（编码植物激素受体），D3（编码SCF的泛素连接酶的F-Box部分），OsTB1（编码TCP结构域转录因子）和OsSPL14（编码SBP结构域转录因子）等

（4）【qRT-PCR】高N会减少分枝抑制基因的mRNA含量，ngr5中无此现象。

（5）分蘖数d14,osspl14<ngr→D14和OsSPL14对NGR5具有上位性→表明D14和OsSPL14是NGR5的下游基因，并且NGR5是通过抑制分枝抑制基因来促进分蘖的

（6）【ChIP-PCR】【EMSA】NGR5可以结合到D14和OsSPL14上，且结合效应和N供应水平呈正相关关系

（7）在NGR5中，N增加，D14和OsSPL14的mRNA含量降低，NGR5结合能力增加，H3K27me3型组蛋白甲基化程度增加→NGR5通过与分枝抑制基因结合，调控H3K27me3水平抑制其表达，从而促进N响应的分蘖增多。

3. NGR5招募PRC2实现H3K27me3

（1）【酵母双杂】【BiFC】【Co-IP】NGR5-LC2（PRC2的组分）互作

（2）lc2/lc2 p35S::NGR5不表现N对分蘖的促进作用

分蘖数：d14/osspl14<<lc2→NGR5对N对分蘖的促进依赖LC2，且D14/OsSPL14对LC2有上位性

（3）N供应可以改变全基因组的H3K27me3的甲基化作用，但在ngr5中改变程度被减弱。→N对H3K27me3的甲基化作用依赖于NGR5

（4）【ChIP-seq】NGR5和LC2共同识别453个结合位点，大多含有GCCGCC基序（在ngr5的上升基因和N诱导基因中常见）

（5）野生型中D14和OsSPL14的转录随着N增加而减少，H3K27me3甲基化随着N增加而增加，但lc2突变体无这些现象→表明NGR5招募PRC2复合体（LC2为组成成分），H3K27me3甲基化修饰D14和OsSPL14等基因，抑制分蘖抑制基因的表达，促进芽生长和分蘖数增多。

4. NGR5是GA受体GID1的靶标

（1）氮诱导的分蘖数在GRVs显著提高，该效应被外源GA处理抑制

（2）【RNA-Seq】【ChIP】NGR5和GA有许多共同调控基因

（3）GA处理和ngr5均可以抑制全基因组的H3K27me3修饰模式，但是PCA处理可以部分恢复H3K27me3修饰模式

（4）GA₃也会抑制N促进H3K27me3修饰模式的调节，促进分枝抑制基因的表达→表明N和GA介导的分蘖效应之间存在一定的联系。

（5）已知GA+GID1结合，招募DELLAs，其被GID2，SCF^GID在26S蛋白酶体中降解，促进植株生长。

NJ6-gid-10分蘖数增加

NJ6-sd1+过表达GID1 对N不敏感，分蘖数减少

GA会抑制NJ6、NJ6-sd1的分蘖数，但对NJ6-sd1-ngr5、NJ6-gid1-10、NJ6-sd1+GID1过表达不影响→GA诱导或GID1介导的分蘖抑制作用与ngr5的作用相似→GA-GID1介导的分蘖抑制作用依赖于NGR5的氮调控作用。

（6）NGR5与GA含量呈负相关，且GA对NGR5丰度的抑制作用可以被MG132处理缓解

【Western Blot】存在MG132时，多泛素化的NGR5积累→GA会促进NGR5的泛素化和在26S蛋白酶体中的降解

（7）在NJ6-gid1-10中GA诱导NGR5降解不存在→该反应依赖于GID1

（8）GA响应一般是GID1激活DELLAs的降解，但是GA介导的NGR5降解在有无DELLA蛋白均可以发生，slr1-d6突变体中NGR5的降解任然能够被外源GA处理所降解→GA促进的NGR5降解不依赖于GA诱导的DELLAs降解，也不是其下游反应。

（9）【SFLC】【Co-IP】GID1可以和NGR5直接互作，互作强度随GA浓度升高而增强（与DELLAs机制一样）→NGR5是GID1多泛素化的潜在底物

（10）NGR5的AP2-R2能够使GID1和NGR5互作，NGR5也能和GID2互作

（11）【体外泛素化实验】NGR5可以被GID2泛素化→NGR5是SCF^GID2复合体的底物

（12）MG132 、gid1-c1，gid2不表现GA促进NGR5的降解→GA介导的NGR5的降解不是由于GA促进DELLAs的降解，而是由于直接互作，且GA促进NGR5-GID1互作，导致NGR5被SCF^GID2复合体多聚泛素化降解。

5. DELLA-NGR5调节分蘖N响应

（1）【酵母双杂】【BiFC】【Co-IP】NGR5和SLR1（DELLA蛋白）互作，且SLR1不会抑制LC2-NGR5的互作→SLR1-NGR5之间的互作不直接干扰LC2-NGR5互作（NGR5功能发挥）→SLR1和NGR5都是GA-GID1-SCF^GID2的底物，且直接互作

（2）LHR1基序是NGR5和SLR1互作的基序，且包含LHR1基序的GRAS蛋白DLT和MOC1（分蘖控制相关）也和NGR5互作→→SLR1和NGR5竞争与GID1的结合，会导致NGR5的积累，并进一步增加SLR1

（3） 【FRET】Rht-B1b（DELLA蛋白增强）、野生型Rht-B1a、SLR蛋白增强的植株中GID1-NGR5互作减弱,且NGR5的降解速率下降

（4）竞争性实验表明，NGR5的降解速率快于SLR1→NGR5和SLR1的竞争性于GID1互作，使NGR5-GID1互作减少→增强DELLA功能可以抑制GID1-NGR5的互作，从而稳定NGR5。

（5）含SD1，GID1和NGR5等位基因的不同NILs表明DELLA介导的分蘖增多依赖于NGR5的功能。

（6）0.6N in 9311-SD1=0.2N in 9311-sd1→9311-sd1的NGR5丰度和分枝抑制基因D14/SPL14的H3K277me3甲基化修饰程度高，D14/SPL14表达量低→sd1赋予的DELLA蛋白功能增强提高了N供应响应分蘖，并抑制了分枝抑制基因的表达，促进了分蘖增加。

6.NGR5提高产量和对N的利用率

（1）在自然群体中分析了5种单倍型的表达，Hap2表达量相对较高，且无论在高N还是低N条件下，它的NGR5 mRNA的含量最高

（2）含Hap2单倍型或OE-NGR5的株系产量高，表明NGR5具有育种潜力→Hap2品种和NGR5具有育种潜能。

（3）GRF4和NGR5的聚合可以进一步提高产量和N的利用率。

四．主要方法

qRT-PCR、酵母双杂、BiFC、SFLC、FRET、Co-IP、in vivo pull-down、EMSA、无细胞蛋白降解实验、体外蛋白质泛素化试验、ChIP-PCR、RNA-seq、ChIP-seq

五．主要结论

1.N促进分蘖的机制：氮依赖于NGR5的功能，招募PRC2，引起的全基因H3K27me3甲基化修饰的改变，抑制分枝抑制基因的表达，促进分蘖

2.GA与NGR5的关系：NGR5是 GA-GID1-SCF^GID2的非DELLA的靶点，促进NGR5的泛素化降解（GA促进NGR5的降解，既不依赖DELLA蛋白，也不是其下游反应）

3.NGR5和DELLA的关系：NGR5-DELLA-GID1存在竞争性的相互作用，增强DELLA的功能，可以减弱了NGR5-GID1的互作，促进NGR5的稳定性，促进分蘖，增加产量。

六．文章创新点

已知NGR5是参与生长素和油菜素甾体信号的相互作用的关键基因，我们的发现进一步加深了对植物激素信号和N肥之间互作，以适应环境的的多种分子模式的理解。

最后，该文章表明已经表明可以通过同时增加GRF4和NGR5的表达，在减少氮肥施用量的情况下，提高对N肥的利用率，持续提高产量，为实现“少投入、多产出、保护环境”的可持续农业发展提供了一种新的育种策略。

七．思考

除了Hap2单倍型，其他单位型中增强NGR5的功能，是否可以同样增加分蘖，且效果更佳明显？

【补充知识点】：

1. 组蛋白修饰：组蛋白富含带正电荷的精氨酸和赖氨酸，可以与带有负电荷的DNA分子紧密结合。每个核心组蛋白由一个球形结构域和暴露在核小体表面的N端尾区组成，其N端氨基酸末端会发生多种共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、泛素化、磷酸化、ADP-核糖化和SUMO等。

2. 组蛋白修饰的类型

2. 组蛋白甲基化修饰的类型

4.D14（编码植物激素受体），D3（编码SCF的泛素连接酶的F-Box部分），OsTB1（编码TCP结构域转录因子）和OsSPL14（编码SBP结构域转录因子）的作用机制

查文献

5主要实验方法的汇总

附：2018年该实验室在Nature杂志发文证实水稻生长调节因子GRF4不仅是一个植物碳-氮代谢的正调控因子，可以促进并整合了植物氮素代谢、光合作用以及生长发育，而且GRF4也是赤霉素信号传递途径的一个关键元件，它能与DELLA蛋白互作。GRF4与水稻生长抑制因子DELLA相互之间的反向平衡调节赋予了植物生长与碳-氮代谢之间的稳态共调节。通过将GRF4-DELLA平衡向GRF4丰度增加倾斜，可在维持半矮化优良性状的同时提高“绿色革命”品种的氮肥利用效率并增加谷物产量。GRF4新功能的发现不仅丰富了我们对于赤霉素信号传导分子机制的认识，而且从分子水平阐明了“绿色革命”矮杆育种伴随氮肥利用效率低下的原因，并提出了通过调控植物生长-代谢平衡实现可持续农业发展的一种新育种策略