二十多年前，曾经受邀面试辉瑞公司的生物医学部，主要研究方向就是疫苗，看到mRNA疫苗通过FDA的批准，让我有许多感叹，辉瑞公司需要与德国的BioN公司合作，也可见辉瑞的生物医学部的实力还不太强。

回顾当年那段疫苗经历，有点重生的感觉，若干年前后，我在博士母校校友年会上做了一次演讲，会后研究中心主任邀请我加盟开实验室，因主持医院的领导工作外加睡眠医学中心，已经没有时间埋头实验室了。当年有一个梦，回国教书，教授肿瘤和粘膜免疫，那个年代，没有背景人脉很难找到位置的。08年回国，我将全套幻灯带在身边，可惜竟找不到一个交流机会与同学们分享，在此就不多说了，以下我将从背景，思路，方法和结果，科普一下这段疫苗改造创新的经历。

九十年代，核酸疫苗非常火爆，绝大部分人不知道的是，默克公司曾经做过一个核酸疫苗的临床试验，但悄无声息的失败了。当时疫苗领域的头面人物，见到我们的项目，给予了很高的评价，认为是这个领域的一个突破，差不多同一个时间里，mRNA疫苗出现了，也是令人非常惊艳的。

介绍一下我的背景，当年工作的实验室曾经是一个叫JERRY MCGEE下面的一个小组，粘膜免疫是免疫大领域里的一个分支，JERRY MCGEE开创了这个分支，可以说是开山鼻祖，他退休后，这个小组来到蒙大拿专职开发粘膜免疫疫苗。粘膜免疫学科是研究粘膜里的免疫系统及其免疫反应的，他手下有两个小组，一个是做疫苗开发，另一个是做免疫耐受的，其特殊之处在于粘膜免疫反应的分析，其独特的粘膜系统实验方法，可以说是独门利器。当年并不知道那么多，一位芬兰朋友告诉我这个实验室是世界上粘膜免疫最顶尖的之一，是JERRY MCGEE的嫡传。

那个年代，艾滋病肆虐，除了血制品传播外，有许多是经性交粘膜传播的，如果能诱导粘膜免疫反应，是否能阻断艾滋病的传播？这是研制粘膜免疫载体的第一个思路。其实在我们实验室里有各种疫苗载体包括佐剂蛋白，腺病毒，细菌载体等等，而当时波士顿儿童医院的一个小组的工作引起了注意，将病毒抗体包装成微粒后，经胃肠道诱导了很好的粘膜抗体免疫反应，而抗病毒细胞免疫反应要差得多。活性载体如腺病毒细菌载体效率非常好，然而副作用毒性却很大，而佐剂蛋白及微粒包装副作用不大，然而效率却很低，能否做出一个载体，既有活性载体的高效率，又能将毒性副作用降到最小，这是研制课题的第二个思路。

最初的设想是用微粒包裹核酸，再点缀上导向蛋白，由导向蛋白将微粒导向粘膜淋巴系统的激发节点。那么选择制取导向蛋白及微粒便成了关键的两步。

先说说导向蛋白的选择，呼肠孤病毒（REOVIRUS）对于粘膜淋巴系统的节点如肠道的PEYER’s PATCH有极强的吸附，是通过外包裹的病毒σ1蛋白，这个蛋白便成了我们的首要选择，如何制取却大费周折。记得国内上课的生化教授打趣说，基因工程可以让一克蛋白产生一公斤黄金的价值，当年让我很是神往，这也是我当年出国求学的初衷之一，可当真正操作制取时才知道黄金难炼。大致程序是找一个细菌表达系统，将病毒基因克隆进去，养细菌造病毒蛋白，可是细菌养好了，蛋白却提取不了，原来病毒σ1蛋白是个三聚体，必须在细菌培养的早期某个阶段，用某种浓度盐溶剂，将蛋白溶成单体才能提取，而且一不当心就聚合失去活性，经过无数次摸索才掌握窍门，其中的挫折和艰辛可想而知。

如何将核酸包装进微粒，为什么要包装成微粒？这里有一个口腔消化道的生理背景。消化道粘膜表面有一层粘液，食物颗粒如何吸收转运是非常复杂的，当年有一篇文章，分析出粒子的大小有直接关系，太大太小都不行，这么点东西就发了科学杂志。如果要诱导粘膜免疫反应，微粒载体大小是非常重要的。记得波士顿儿童医院提供了protocol，其中一个超声波制取微粒的仪器，我们实验室并无类似设备，我就和高年资技术员一起想办法，土法上马利用实验室一台超声波细菌破壁机做声源，虽然效率差了一些，最终制取出微粒，整个过程还是非常好玩有趣的。

接下来便是体外细胞实验和动物模型实验，忙活了几个月终于将初期设想做出来了，然而进一步的实验却大出所料。首先是体外细胞的毒性很大，大片的细胞死亡，动物实验，小鼠的毒性也很大，实际测出的粘膜免疫抗体滴度并不高，小鼠非常不健康，而且也有死亡的，让我很失望，一度陷入深思，当时卫生研究院给出期限，如果三到六个月没有结果的，这个项目就放弃了。

日思夜想，连做梦都在思考，灵光一现，让我想到了基因治疗，其中有一个受体介导的基因转入。于是，我将σ1蛋白联到多聚赖氨酸上，再利用多聚赖氨酸的极性去包裹核酸，这样一个粘膜核酸载体就做成了，体外细胞实验很成功，接下去的动物实验还是出现了挫折，经口腔肠道的反应很不理想，而再次经鼻粘膜的诱导取得了很大成功，不但诱导出粘膜抗体免疫反应，还诱导出理论上不太可能出现的细胞免疫反应，这里可以看出口腔肠道生理的复杂性，对微粒大小有很高的要求，而鼻黏膜却完全不一样。

这个粘膜核酸载体得到国家卫生研究院另一个小组的重复和证实，那年在华盛顿一个重要年会上受到高度关注，也受到许多质疑，其中有争议的是细胞免疫反应，当时理论上不太可能出现的现象，也说明黏膜免疫机理有许多未知之处，瑞典的科学家（Current Opinion in Immunology Volume 14, Issue 5, 1 October 2002, Pages 666-672）认为这是首次用非活性载体诱导出类似活性载体，如病毒细菌，的黏膜免疫反应，意义重大，并对机理进行了探讨。这篇工作本来准备投自然杂志，但由于机理不明，实验设计要求不同，最后被PNAS接受 （M cell-targeted DNA vaccination，PNAS July 31, 2001 98 (16) 9318-9323），我曾经收到两位院士的评论信，一直收藏至今。十三年后，我在医院查房，无意收到一个信息，原来这个工作被2013年自然杂志关于粘膜免疫领域进展综述再次提及（Mucosal Immunology volume 6, pages666–677(2013)，让我感慨不已，那段时日是我家庭和经济最拮据的时日，却是我人生中最闪光的一段时日。