阴茎癌的分子发病机制-目前发展和理解

Anthony Emmanuel, Jeremy Nettleton, Nick Watkin, Daniel M. Berney.

编译：河北工程大学附属医院泌尿男科  杜江平

摘要  阴茎鳞状细胞癌是一种罕见的恶性肿瘤，具有不同的组织学亚型，每个亚型都有不同的表现，其组织型特异性又与人乳头瘤病毒（HPV）和临床行为有关。尽管有丰富的病理学知识，但对于控制阴茎癌变的基本分子驱动因素及其潜在的预后和治疗重要性了解仍然十分有限。然而，最近的研究提高了我们对阴茎癌发病分子机制的基本认识：通常分为HPV依赖性和非HPV依赖性两种致病途径。本综述旨在总结阴茎癌组织病理学和分子发病机制的最新进展，随着新一代测序技术的出现，探讨分子靶向治疗转移疾病机会。

关键词  阴茎鳞状细胞癌；人乳头瘤病毒；阴茎上皮内瘤变；组织型；癌变；遗传学

引言

阴茎鳞状细胞癌是一种罕见的疾病。约占所有男性恶性肿瘤的0.5%。欧洲PSCC的发病率在地理上从0.5到1.6/100000人口不等[1]。这种恶性肿瘤主要发生在老年男性，发病率随着年龄的增长而增加，最高发生率在50-70岁之间[2]。

阴茎肿瘤最常见的来源于阴茎腺上皮、包皮（包皮）和冠状沟，而不常见于阴茎体。它们可能由癌前病变阴茎上皮内瘤样病变（PeIN）的恶性转化引起。这种情况的发生率没有很好的定义，但如果不治疗，大约30%的病例会出现这种情况[3，4]。

PSCC是多因素致病，有许多已识别的风险因素，其中一个最重要和广泛的就是感染人乳头瘤病毒（HPV）。大约33%的PSCC病例与人乳头状瘤病毒感染相关[5]，类似于外阴癌[6]和头颈癌[7]，其他危险因素包括包茎、慢性炎症状态、阴茎卫生不良、阴茎外伤、性伴侣人数多和吸烟[8，9]。虽然很少见，但少数PSCC以早期局部定位和血管淋巴扩散而闻名，预后较差。标准的临床病理参数建立良好，是指导当前患者管理和预后的主要手段。其中最重要的是淋巴结转移和范围，这是PSCC患者长期生存的关键决定因素[10]。

晚期PSCC的主要挑战之一仍然是根治性腹股沟淋巴结切除术的患者选择，其可导致严重的发病率，在临床上淋巴结阴性的患者中，约25％具有隐匿性转移。由于目前尚未对临床实践进行验证的分子生物标志物，临床上淋巴结阴性的患者的管理主要依赖于临床病理参数的风险分层，通过双侧改良腹股沟淋巴结切除术或动态前哨淋巴结活检进行监测或侵入性淋巴结分期[1,2]。

晚期PSCC的管理仍然很困难，鉴于大多数都是抗放化疗特性，一线治疗方案失败时，可选择的治疗非常有限[1,10]。放疗仅用于晚期患者的姑息治疗，能够改善局部区域，控制广泛转移和/或淋巴结外扩散[2]。PSCC的化学疗法用于治疗和缓解晚期或转移性疾病，以及用于局部侵入性或固定的腹股沟淋巴结的新辅助和辅助设置。目前PSCC的一线化疗包括紫杉醇、顺铂和5-氟尿嘧啶或异环磷酰胺（TPF或TIP），因为这些方案显示出良好的客观肿瘤反应[11,12]。一线治疗最终失败后，PSCC全身治疗的二线化疗选择有限。对于难治性疾病患者，一些靶向治疗剂已被用作二线治疗，但效果不大。这些药物包括抗表皮生长因子受体单克隆抗体（如帕尼单抗[13]）和受体酪氨酸激酶抑制剂（如索拉非尼和舒尼替尼[14]）。

由于晚期PSCC标准化疗的缓解率低，人们越来越有兴趣发现新的靶向疗法来改善这种结果。然而，阴茎致癌的分子机制仍然是未知的，很少研究。英国已经建立了超区域PSCC网络，国家和国际研究合作无疑将改善患者管理，提高对这种疾病的理解，并可能引导生物标志物识别和治疗PSCC新策略。本文综述PSCC病理学和分子发病机制的新认识。

阴茎癌的组织学分类

鳞状细胞癌约占阴茎所有恶性疾病的95%。其余5%包括透明细胞、髓质和基底细胞癌到黑色素瘤和肉瘤其他[9，15]。

尽管PSCC是最常见的阴茎肿瘤，存在各种不同的组织学亚型，包括那些混合组织学。 国际泌尿外科病理学会（ISUP）最近审查了世界卫生组织2016年阴茎癌症分类的专家共识[16]。 其中一项建议是根据与HPV的关系，对PSCC的大量变异进行分类，如表1所示。一般来说，除腺鳞癌和肉瘤样变体外，HPV阴性的肿瘤级别低、成熟度高[16,17]。

主要HPV相关的PSCC组织学亚型包括疣状和基底样类型，主要的非HPV 相关PSCC组织学亚型包括疣、疣状的、乳头状的、未另行规定的（nos）和肉瘤样亚型。表2总结了这些主要亚型及其频率、总体特征和与HPV特异性关联的组织类型和临床侵袭性[18、19、21]。尽管与HPV无关，疣状和乳头状肿瘤仍存在一些HPV阳性肿瘤，这反映了PSCC异质性和在诊断某些变异时组织病理学的困难，特别是罕见和混合组织学亚型。此外，虽然PSCC的常见亚型被归类为非HPV相关变异体，但这些肿瘤中约有三分之一与HPV相关，通常为HPV 16。

p16INK4A在诊断HPV相关肿瘤中的价值

在研究中存在多种检测HPV的方法，从使用PCR如INNO-LiPA HPV基因分型额外扩增试剂盒或原位杂交技术。然而，作为一种昂贵的替代方案，多项研究表明，p16^INK4A蛋白的免疫组织化学过度表达可用作高风险HPV（hrHPV）感染的替代标志物（总体一致性为84％）。 此外，p16^INK4A还可以帮助分类和诊断形态学具有挑战性的病例，不同PSCC亚型的诊断和鉴别诊断低级疣和高级实体阴茎肿瘤[16,22,23]。因此，ISUP推荐病理学家使用p16^INK4A免疫染色既检测HPV感染又辅助肿瘤分类[16]。

虽然p16^INK4A免疫组化染色是一种有用的辅助手段，但确实存在一些潜在的问题。首先，这种方法只能将样本区分为hrHPV阳性或阴性，没有HPV基因分型的可能性。尽管p16^INK4A免疫组化染色显示出高度一致性，但仍有少量hrHPV阳性肿瘤可能遗漏，例如同时发生的那些 通过失去杂合性或启动子高甲基化使p16INK4A基因失活。 此外，各种p16^INK4A染色模式的解释和确定阳性结果的最佳截止点已被证明是有争议的，尽管先前的研究表明，强度全厚度p16^INK4A染色模式与HPV相关的PSCC亚型和hrHPV最佳相关[22，24]（图1）。

阴茎癌前病变

PeIN也按其与HPV的关联性分类为分化（非HPV相关）和未分化（HPV相关）PeIN。分化PeIN约占阴茎癌前病变的75%，临床表现为扁平或稍高的苍白/白色或红斑病变，与苔藓硬化有关。由于它们与人乳头瘤病毒无关，通常是p16 ^INK4A阴性，可能引起常见的疣和疣状肿瘤。相反，未分化PeIN占阴茎癌前病变的25%，通常是在阴茎龟头和/或包皮上发现的扁平红斑病变，常可见基底样/疣状形态特征。它与hrHPV亚型相关，通常p16 ^INK4A阳性，可能引起基底样、疣状或常见类型的阴茎肿瘤[18，25]（图1）。

阴茎癌的分子发病机制

阴茎癌发生的分子机制很大程度上仍然未知，这在很大程度上归因于疾病的罕见性，而且用于分子和转化研究的病例数量和组织材料有限。 随着PSCC中心的建立和各种合作努力的增加，人们对其会有更多了解，对阴茎癌发生的分子机制也将有更深入了解，进而引发鉴定PSCC生物标志物和新治疗策略。

我们对PSCC潜在病因基本理解是，认识到其异质性和两种不同分子途径致癌作用：HPV和非HPV介导的途径。下面讨论这些途径的详细概述（图2）。

HPV依赖性阴茎癌机制

人乳头状瘤病毒是一种无包膜的小环状双链DNA病毒。有100多种已知的HPV变种，其中约40种已知会感染肛门生殖器粘膜[26]。这些粘膜HPV分为高风险组和低风险组，反映了它们导致的病变的恶性潜能，发展为侵袭性癌症，如宫颈癌、肛门癌、外阴癌或阴茎癌（表3）。

HrHPV与所有阴茎癌病例中的约33％相关，HPV16是最常见的亚型[5]。 低危HPV（lrHV），如HPV 6和HPV 11，更常见于良性病变。 这些lrHPV变体不被认为与癌发生有关，因为已经证明它们的癌蛋白不会引起RB和p53肿瘤抑制途径的显著失调，导致最低p16^INK4A上调[27]。 然而，这些lrHPV变体常见于PSCC，HPV 6是该肿瘤中发现的第二常见HPV亚型[3.7％] [5]。

HPV病毒体被认为通过微擦伤和特定受体如硫酸乙酰肝素蛋白多糖和α6整联蛋白获得并感染上皮粘膜的基底细胞[28]。 持续的上皮HPV感染和HPV DNA整合到宿主细胞基因组中导致转化的恶性表型。 这导致基因组不稳定性和高风险病毒癌蛋白E6和E7的过度表达，其对细胞周期控制发挥调节作用，这是维持癌症表型的关键[26]。

hrHPV E7癌蛋白与pRB结合并使其失活，释放转录因子E2F以激活参与DNA合成的基因并导致不受控制的细胞周期进展[29]。由于p16^INK4KA和pRB之间负反馈环的破坏，该过程导致p16^INK4A的过表达[20,21,30]。 这使得p16^INK4KA过表达可用作PSCC转录活性HPV感染的替代指标，这已经被多个研究组证实[22,23,31]。

hrHPV E6癌蛋白靶向p53肿瘤抑制蛋白，用于蛋白酶体介导的降解。 这导致阻止DNA修复、生长停滞和细胞凋亡，并使感染细胞易于累积继发性遗传事件，例如最终导致癌突变[21]。

以前的研究还注意到癌蛋白E6和E7的其他重要致癌功能。 一个例子包括HPV E6癌蛋白介导的端粒酶活化通过c-myc诱导的人端粒酶逆转录酶（hTERT）表达[32]和NFX1-91的降解，NFX1-91是hTERT启动子的抑制因子[33]导致细胞永生。 E6和E7癌蛋白均可通过异常中心体合成和有丝分裂检查点颠覆等机制诱导基因组不稳定。导致突变和结构染色体异常的发生率更高，导致染色体重排[26]。

非HPV依赖性阴茎癌机制

HPV阴性阴茎癌发生背后的遗传机制尚不清楚。然而，基因测序的重大进展已经发现在阴茎癌发生期间发生的多种基因组改变，并且这些改变在下面被分类和讨论。

慢性炎症

慢性炎症是PSCC的一个已知危险因素，其病况会导致慢性刺激/损伤，因此炎症（如包茎、龟头炎和苔藓硬化）与该恶性肿瘤的发展密切相关[1，9]。

炎症的一个关键介质（环氧合酶-2）在早期PeIN、侵袭性PSCC和淋巴结转移中有很强的表达，但在正常组织中没有表达[34]。环氧合酶-2的过度表达导致血栓素和前列腺素（特别是前列腺素E2）的过度产生，通过激活多个途径（其中一个途径是PI3K-AKT途径）在增殖、侵袭和血管生成中起到关键作用[35]。

体细胞遗传改变

杂合性缺失（LOH），突变，缺失，拷贝数增加/扩增和表观遗传修饰的多种遗传改变作为致癌作用的机制，已经在PSCC的各种途径中得到证实。

主要肿瘤抑制途径p16 ^INK4A/cyclinD / RB和p14ARF / MDM2 / p53的失调也被发现是由促进阴茎癌发生的非HPV机制引起的。p16 ^INK4A基因常被LOH灭活，通过DNA甲基化沉默，p16 ^INK4A免疫表达缺失，与淋巴结转移和疾病复发显著相关[36，37]。此外，在PSCC[30]中发现了导致p16 ^INK4A和p14ARF下调的BMI-1多梳基因的过度表达。

TP53等位基因缺失和突变、p14ARF突变和甲基化以及小鼠双分钟2同系物（MDM2）的过度表达（这是TP53的负调节因子）也在PSCC中显示[38，39]。TP53突变也可导致p53突变蛋白表达增加（90%）或p53蛋白表达缺失（10%）[9]。p53在PSCC中的免疫表达在41.5%到89%之间，与PSCC预后不良有关[9，20]。最近由Faraj等人证明，胰岛素样生长因子-1受体（IGF1R）已知在细胞生长和转化中起作用，[40]IGF1R的表达与PSCC的组织学分级、亚型和HPV有关，具有潜在的预后相关性，需要进一步研究。

已显示失调的PI3K-AKT-mTOR途径在阴茎癌发生中起作用。Stankiewicz等[41]发现刺激PI3K-AKT-mTOR信号传导的p-EGFR，HER3和HER4在148例PSCC病例的队列中过表达。他们还报道HPV阴性肿瘤比HPV阳性肿瘤表达显着更多的p-EGFR，并且该表达与p-AKT相关（p = 0.002）。抗EGFR抗体如帕尼单抗靶向抑制EGFR的数据有限，已经显示出晚期PSCC患者有希望的结果[42]，这与最近的一项研究相关，该研究显示EGFR基因的多体性和扩增是阴茎癌特定死亡率的独立危险因素[43]。

已发现PIK3CA癌基因在8-9％PSCC病例中发生突变[44,45]。RAS激活突变在癌症中是常见的，并且已在1-19％PSCC中发现[45-47]。另一方面，PTEN（肿瘤抑制基因和PI3K途径的阻遏物）免疫表达降低是62-75％PSCC病例的常见事件[41]。

Ferrandiz-Pulido等[48]在67例PSCC病例中发现pmTOR和p-elF4E免疫表达在PSCC中显着高于邻近正常组织并且与淋巴结转移（LNM）相关（分别为p = 0.05和p = 0.006）。其次，Chaux等[49]发现，在112例PSCC病例中，磷酸化S6（mTOR的下游效应蛋白）免疫表达在低度恶性肿瘤中显着升高（p = 0.001）。这表明mTOR在早期和晚期阴茎癌发生中起作用，并且可能代表有吸引力的治疗剂目标。但是，我们最近的论文淡化了其重要性，我们发现正常阴茎的PI3K-AKT-mTOR通路上皮细胞的p-AKT（p = 0.0247）和p-mTOR（p = 0.0041）的蛋白质表达水平高于PSCC [44]（表4）。

基因组拷贝数变异

拷贝数变异（CNVs）是一种结构变异，其中大量的DNA碱基对被复制或删除。两项研究通过阵列比较基因组杂交方法分析了PSCC中的基因组变化，寻找PSCC中CNVs的图谱。La Touche等人[51]在64例PSCC病例中报告了1p13.3-q44（88%）和3p12.3-q29（86%）染色体的复发性增长和2q33-q37.3（86%）和11q12.2-q25（81%）染色体的丢失。在HPV阳性和HPV阴性PSCC病例中发现了相似的遗传变异模式，这为HPV阳性和HPV阴性的PSCC靶向相似的分子途径和两者可能利用最后的共同致病途径提供了证据。

Busso-Lopes等[52]在46例PSCC病例中发现，在损失3p21.1-p14.3的情况下，癌症特异性存活率（CSS）和无病生存率（DFS）显著降低（p = 0.0006和p = 0.023）和3q25.31-q29的增益（p = 0.017和p = 0.042）。这些区域可能在PSCC中具有潜在的预后生物标志物和未来的治疗靶点。他们还指出DCL1和PPARG的丢失也与预后较差有关。他们还确定了19例特异性基因组改变，这些改变在HPV阳性PSCC病例中更常见，从而支持两种不同PSCC病因的假设：一种HPV依赖性，另一种非HPV依赖性（表3）。

异常的microRNA表达

microRNA（miRNA）是小的非编码RNA，其在RNA沉默和基因表达的转录后调节中起作用。 最近，很明显miRNA在癌症发生中起作用，因为它们经常在人类癌症中失调和异常表达[28]。 Hartz等[53]发现三种miRNA（miR-1，miR-101，miR-204）的丢失与LNM和PSCC预后不良有关，在开发miRNA特征组以辅助风险分层方面具有潜在的临床应用价值。 通过预测早期PSCC转移的形成。此外，已发现SLC8A1的下调miR-223基因可导致PSCC钙水平降低，从而抑制细胞凋亡，增加细胞增殖[54]。

张等[55]在10个pscc和匹配的相邻正常组织样本中使用下一代测序技术进行了第一次小RNA分析。他们发现56个在配对组织间表达显著不同的小RNA，异常小RNA表达的假定靶基因与致癌过程中建立的信号通路（如MAPK、p53和PI3K-AKT通路）密切相关。最近的一项综合分析发现，与通常的临床病理数据相比，MMP1表达水平的增加是PSCC中LNM更好的预测指标[56]。

异常免疫表达

癌细胞通过导致免疫耐受状态的各种机制抑制和逃避宿主免疫应答。免疫耐受性增强检查点之一是程序死亡-1（PD-1）/ PD-1配体（PD-L1）轴，如PD -L1与PD-1结合，这导致T细胞活化和增殖的抑制。针对该途径的免疫疗法的最新进展已在各种泌尿系统恶性肿瘤中显示出巨大前景[57]。

Udager等[57]首次在PSCC中研究该轴，发现62％（23/37）的肿瘤PD-L1表达呈阳性，与LNM相关（p = 0.024），CSS减少（p = 0.011））。这些结果已被Ottenhof等[58]证实，显示48％（96/200）中PD-L1表达水平增加，从而为PSCC中未来的抗PD-1和抗PD-L1免疫治疗选择提供了希望。

基因分析和下一代测序

最近，随着新一代测序（NGS）的到来，进行了更深入的研究和综合分析。其中之一，Feber等[50]通过全外显子组测序分析PSCC的体细胞突变情况，发现27例PSCC病例中复发的体细胞突变很少，810例突变基因中仅有137例（17％）复发事件被鉴定出来，其中最多 在TP53（19％）和CSN1（17％）中很常见。 在HPV病毒载量的分层上，他们发现高病毒载量肿瘤，他们通过qPCR定义为> 1 HPV拷贝/细胞，与HPV阴性肿瘤相比具有显著（p <0.05）更低的突变负荷。早期的NGS研究发现缺乏p16表达和MYC和CCND1扩增与较短的进展或存活时间显著相关[59]（表3）。

Araujo等[60]在PSCC中进行的最近和第一次线粒体基因组分析发现PSCC中线粒体基因组不稳定性增加是由于更高频率的异质性和线粒体DNA耗尽。Yang等[61]对11个PSCC样本进行了多平台激酶分析和基因表达平台，发现PTEN，STAT3，GNRH，IL- *和B细胞受体信号通路在PSCC中最常被上调。然而，这项研究是在少数样本中进行的，因此需要进行更大规模的转化研究来验证这些研究结果。Marchi等[62]在20个PSCC样本中进行的综合综合分析确定了顶级驱动基因，包括PPARG，RB1，AR和STAT1，发现较短的OS与BIRC5（p = 0.026）和DNMT3B过表达相关（p = 0.002）），突出其作为PSCC的新型预后标志物的潜力。

结论

随着下一代测序方法出现和国际/多机构合作，对阴茎癌潜在分子致病机制，会有越来越多了解。PSCC很明显有多种驱动因素，且有不同的遗传和表观遗传变化，并有潜在的预后和治疗意义。在未来，应该有更多的功能性研究来进一步评估这些驱动因素。此外，需要进行转化和临床研究，将这些潜在的关键驱动因素和途径转化为临床适用策略，以改善目前阴茎癌治疗现状。

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心得体会：该文献对目前有关阴茎癌分子水平致病机制，阐述的很细致。就像文献结论所说，期待在新的基因测序推广之时，能更为明确阴茎癌致病原理；也非常期待相对应转化医学研究获得突破，能为阴茎癌靶向治疗提供良策。