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非编码RNA学科的研究历史及最新研究进展

已有 11070 次阅读 2014-5-7 16:14 |个人分类:文献阅读|系统分类:科研笔记

最早的非编码RNA研究可追溯到上世纪50年代，早期发现的两类非编码RNA分别是核糖体RNA(rRNA)和转运RNA( tRNA)，它们在实施蛋白质翻译过程中发挥关键作用。1977年发现了断裂基因（split gene），使人们认识到在基因组水平遗传信息编码的不连续性，U1、U2等一批核小分子RNA（snRNA）的发现及mRNA剪接体功能的阐明，极大地促进了在 RNA 转录后加工水平解读遗传信息表达的过程及机制。1982年自我剪切核酶的发现，不仅为生命起源于“RNA世界”的假说提供了分子证据，而且预示在细胞中存在大量具有催化功能的调控RNA。1986年，在锥虫的线粒体中发现了RNA编辑现象，即由一批向导RNA（gRNA）所介导的遗传信息的改变。RNA编辑现象的发现，打破了基因与蛋白质的线性传递规则，进一步揭示了非编码RNA在遗传信息表达过程中的调控作用。

20世纪九十年代以来，在细胞中陆续发现各种新的非编码RNA。90年代初始，在真核生物及古细菌中发现大量的snoRNA及类似小RNA，在分子生物学领域中刮起了“核仁风暴”^[1]。snoRNA是富集于真核生物细胞核仁内一类小分子非编码RNA，它们是细胞内主要的rRNA修饰和加工系统，并参与snRNA等其他非编码RNA的修饰。人类细胞有300多个snoRNA基因，而snoRNA介导的RNA修饰密码，其生物学意义迄今尚未破解。在哺乳动物遗传印记区编码了大量孤儿snoRNA，它们与遗传印迹基因的表达、胚胎的发育调控、以及人类重大疾病如PWS综合症有密切的关系。

1993年，哈佛大学Ambros 在线虫中发现了第一个微RNA lin-4及在胚胎发育中的功能^[2]。但是直到2000年在线虫中发现了第二个类似的微RNA，let-7，并发现它在多细胞动物中保守存在。2001年，Science同一期报道3 个研究小组在线虫、果蝇和人cDNA文库中鉴定出近百个与lin-4和let-7相似的的小分子RNA，并统一命名为microRNA (miRNA，微RNA)。miRNA的发现是非编码RNA研究的里程碑，它揭示了细胞中存在一个由内源微RNA介导的转录后基因表达调控机制。

miRNA是一个巨大的非编码小分子RNA家族，广泛存在于从单细胞绿藻到高等动、植物中，甚至在病毒中也发现了多种miRNA。在人类细胞中已鉴定了千余种miRNA。由于miRNA的靶点具有多向性，在一个细胞中miRNA通路至少可控制30%以上的蛋白质基因的表达。同时，由于绝大部分miRNA都具有严格的时空表达特性，不同发育阶段、不同细胞类型中，起着决定性的调控作用的miRNA类群也有所不同。最近还发现，mRNA的结合蛋白参与调控miRNA的靶标选择。由此可见，在真核细胞生物中miRNA构成高度复杂的调控网络，精确地控制着细胞中蛋白质的表达谱，进而决定着各类细胞的功能及命运。另一方面，miRNA与各种疾病有关，在人类肿瘤中都发现大量miRNA表达异常，因此，miRNA表达谱可以作为肿瘤等疾病临床诊断、分类、分级甚至预后的指标，并为治疗提供新的靶点。

1998年，Fire等人首次证实双链RNA分子可诱导RNA干涉作用（RNA interference）^[3] ,随后的研究揭示RNA干涉是由于外源导入的RNA双链经RNase III类核酸酶Dicer切割加工，形成了一些二十几个核苷酸左右的双链小RNA，被称为小干扰RNA（siRNA）。siRNA的发现，揭示了生命细胞内普遍存在的RNA干涉体系及机制，从而获2006年诺贝尔生理医学奖。近年来，在动物、植物以及单细胞生物中都进一步发现了由内源的siRNA介导的转录后基因沉默，甚至在细菌中也存在类似的方式，表明它可能是一种最古老而广泛的RNA调控机制。siRNA介导的RNA干涉技术，在生物和医学中都具有重要的应用前景。

目前，在人类等哺乳动物中已发现了大量的具有调控功能的微小非编码RNA（图1），包括miRNA、内源siRNA、PIWI蛋白结合小RNA(piRNA)、启动子相关小RNA(PASR)、转录终止位点相关小RNA(TASR)、增强子相关小RNA(eRNA)、应急诱导tRNA衍生的小RNA(sitRNA或tRF)、重复序列相关小RNA（rasRNA）等，它们在细胞的功能及命运决定、基因组稳定性以及生命新陈代谢和多样性维持中发挥重要的作用。

图1：非编码RNA 研究历史与发展趋势

最新的研究还表明，细胞中存在大量的长非编码RNA(long non-coding RNA， lncRNA) 。lncRNA是一大类转录长度大于200个核苷酸，但没有长阅读框架和编码能力的RNA。lncRNA的发现可追溯到1990年，在哺乳动物的细胞中鉴定了第一个长lncRNA——H19^[4]。1991年发现的Xist基因表达的lncRNA能够使女性的两条X染色体中的一条失活。使X染色体编码的蛋白质在两性生物中的表达量趋向一致^[5]。近年来，受到小RNA研究的启示和新的技术推动，新的lncRNA被大量鉴定出来，并具有丰富的结构与功能的多样性。例如，1）通过在蛋白编码基因上游启动子区发生转录，干扰下游基因的表达。2）通过抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因表达。3）通过与蛋白编码基因的转录本形成互补双链，进而干扰mRNA的剪切，从而产生不同的剪切形式。4）通过与蛋白编码基因的转录本形成互补双链，进一步在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA，调控基因的表达水平。5）通过与基因之间竞争转录因子的方式导致印记区基因表达的沉默。6）作为脚手架将两个蛋白连接在一起，从而调控基因的转录。7）通过结合到特定蛋白上，改变该蛋白的活性或胞质定位。8）通过转录出与mRNA序列相似的长非编码RNA（如假基因或环状RNA），作为吸引miRNA的分子海绵，从而保护真实功能基因的转录和翻译。9) 作为小分子RNA，如miRNA，piRNA的前体分子转录。

lncRNA不仅参与蛋白质在细胞中的运输，而且通过调节蛋白质的构象及稳定性形成RNP功能复合物。细胞核内的长非编码通过招募染色质重构复合体到特定位点进而介导相关基因的表达沉默，在遗传印记的表达和干细胞重编程中起关键调控作用。lncRNA与基因之间通过竞争转录因子的方式导致印记区基因表达的沉默。特别是最近研究表明绝大多数lncRNA在特异肿瘤中异常表达，可能作为肿瘤诊断和治疗的重要生物学标记，这迅速激起了长非编码RNA研究的热潮。

十年来，细胞中大量的非编码RNA的发现，有力地证明非编码RNA结构与功能的多样性及复杂度，宣告了RNA组学新时代的到来。非编码RNA虽然不编码蛋白质，但是以调控分子等多种身份参与了重大生命活动的各个层次。人们发现，细胞内存在新的分子交流密码，或者称为“RNA语言” ^[6]。即细胞内的各种RNA之间通过不同的识别和作用机制，进行相互沟通和交流，采用相互拮抗、竞争或合作的方式构成庞大的分子网路，监视和调控着细胞内所有生物学过程的运行。

每一类新的非编码RNA的发现都揭示出一种新的基因或细胞调控机制，对生命科学发展产生重大影响。同时，从非编码RNA调控角度揭示人类重大疾病发生的机制，为这些疾病的防治提供了理论依据和新的技术。例如：siRNA的发现，揭示了生命细胞内普遍存在的RNA干涉体系及机制，并为基因表达调控提供了最新的干预技术，2005年以来，在各种人类疾病，特别是肿瘤中发现大批非编码RNA表达失调，其中最显著的是微RNA和长非编码RNA，它们在不同的肿瘤中呈现特异性的上调或下调，作为关键的癌基因或抑癌基因。其中有一些微RNA和长非编码RNA已经被作为某些组织来源的癌症的标志物。近年来，分泌到细胞外的非编码RNA也受到前所未有的关注。它们可能像信号蛋白一样，是细胞间交流通讯的一种分子。同时，进入血液以及循环系统中的非编码RNA作为临床无创检测的分子标志物，具有极高的医学应用价值。为此，美国国家健康研究中心（NIH）最近设立了细胞外RNA通讯（Extracellular RNA Communication，ERC）研究新方向。

欧美主要发达国家都相继启动了以RNA为主要对象的国际重大研究计划。如2003年,美国提出了以解析非蛋白质编码序列为主要目标的“人类DNA元件百科全书计划”(ENCODE)，先后有全世界11个国家80家研究机构、大学和公司参加^[7]。2012年9月该国际协作组在Nature、Science、Genome Research等国际著名期刊上发表了30多篇论文，报道了第二期ENCODE计划的最新成果，其中通过对147种细胞的研究，在人类基因组中证实了18400个非编码RNA基因，并发现人类基因组中超过80%的区域都存在转录产物，这其中隐藏着难以估量的非编码基因资源。2002年欧盟组织18个国家参加的“RNA调控网络与健康和疾病”（RNA in health and disease “Ribonet”) 计划^[8]，分工协调发展欧洲的RNA基础和应用研究，并与欧盟框架计划结合，在病毒、细菌和动植物的非编码RNA、医用RNA干涉或调控技术和RNA结构等研究领域取得了重要进展。日本发起的先后有15个国家50个研究机构参加的哺乳动物基因组功能注释（FANTOM）国际协作组^[9]，开展人类和小鼠RNA转录组的系统研究，已完成10万条以上小鼠全长cDNA序列，目前FANTOM 5计划采用最新的单分子测序技术对基因表达进行研究，将对更多的非编码RNA进行挖掘。