最近有朋友和我交流纳米孔16S测序数据的分析，发现真的没有从头完成过一次这方面的数据分析，然后发现这方面的资料也比较少，于是学习一下，和大家分享。坦白说，牛津纳米孔测序技术在16S多样性研究方面还是有些不足的，只能说勉强够用，主要应用场景是在一些现场快速检测方面，主要是病原菌这种。但是，相信随着测序准确度的提高和分析软件的改进，相信它的应用会越来越多。感谢互联网的便利和分享精神，今天的我们可以方便地获得测序的原始数据，并可以自由进行分析。

1.软件和数据准备

处理牛津纳米孔的测序数据，首先当然要安装相关的专用软件了，基本上原厂出的，原厂品质，放心！还有就是minimap2和yacrd，用于去嵌合。数据来自一篇文章，文件不大，直接下载或者ascp下载均可。

#这个流程可参考https://github.com/tetedange13/stage_M2BI_scripts
#软件准备
#首先是NanoPlot，用于检测测序质量，直接pip安装了，加速的话可使用清华源
pip install NanoPlot 
#去接头的Porechop
git clone https://github.com/rrwick/Porechop.git
cd Porechop
python3 setup.py install
porechop -h 
#质控的NanoFilt，pip或bioconda安装
pip install nanofilt
#minimap2，编译或者下载预编译的二进制文件均可，这里编译
git clone https://github.com/lh3/minimap2
cd minimap2 && make
#yacrd，conda安装
conda install yacrd
#获取数据，我是ascp下载
/Volumes/10.11/Users/zd200572/Applications/Aspera\ Connect.app/Contents/Resources/ascp -i ~/asperaweb_id_dsa.openssh -Tr -Q -l 100M -P33001 -L- fasp-g1k@fasp.1000genomes.ebi.ac.uk:vol1/fastq/ERR277/007/ERR2778177/ERR2778177.fastq.gz .
#比对工具last，一款来自日本的比对软件，需要编译
wget http://last.cbrc.jp/last-1060.zip
unzip last-1060.zip
cd last-1060
make
#blast diamond seqkit
conda install -c bioconda diamond blast seqkit
#如果wget或者浏览器下载地址是wget http://ftp.ebi.ac.uk/vol1/fastq/ERR277/007/ERR2778177/ERR2778177.fastq.gz
#ncbi的16S数据库，由于出国网络差，下了好久，一定要确保数据下载完整,注意下载时勾选gi号，以备后面有用
#https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore?term=33175%5BBioProject%5D
#这里我把这个文件存在了网盘，公众号内回复“16S”即可获得下载地址

2.数据预处理

基本上是质控的过程，先看下测序质量，当然纳米孔的质量还是有点低的，特别是手上下载的数据是低版本的测序芯处R9.4，未来的R10可以通过两个纳米孔串联提高到95%。接着就是去除测序的接头，获得真正的测序序列，是不是引物也应该切除？但是估计数据库里的序列也应该不包含引物，所以估计引物影响不大。然后，进行过滤，除去明显不符合要求的序列。

#查看质量，fastq最常用，这里用官方的试试
NanoPlot -t 4 --fastq ERR2778177.fastq.gz --plots hex dot

结果依然是类似于fastq质控报告的一个函数，不过统计指标少了几个，有两个把reads长度和质量分布放在一起的图不错。

#去接头，4线程，这一步耗时以小时计，对于我的五年前的双核心四线程笔记本 
porechop -t 4 -i input.fastq -o trimmed.fastq
# 质控，质量值为9，长度200过滤，虽然有点低，这有两个重定向
NanoFilt -q 9 -l 200 < trimmed.fastq > cleaned.fastq
#去嵌合，先minimap2自全局比对，发现嵌合，然后yacrd去除
minimap2/minimap2 -x ava-ont -g 500 cleaned.fastq cleaned.fastq > overlap.paf
yacrd -i overlap.paf -o report.yacrd -c 4 -n 0.4 scrubb -i cleaned.fastq  -o reads.scrubb.fq
#卡在这时间最长，主要几个文件要准备，需要整理的已经放在文件夹，其余的可以ncbi下载，较大，没放，或者直接用我建好的。
#看下文件的保留情况，大概去除了一半以上的数据
tree -h | grep q
├── [237M]  ERR2778177.fastq.gz
├── [224M]  cleaned.fastq
├── [200M]  reads.scrubb.fq
└── [476M]  trimmed.fastq

3. 比对

1)选项1，last比对

关于纳米孔16S的数据分析，之前翻译的那篇综述总结了大概有两种，一种是和之前的16S数据分析一样聚类ASV/OTU，但是由于90%左右的准确度，看有用85%的准确度聚类的。。。另一种就是，不聚类，直接进行比对，也就是我们这次学习的blast等比对工具的方法，根据综述作者的观点，这几种工具由于不是专门为纳米孔测序数据设计，不能比较好的完成物种注释的任务（不够准确），作者推荐的是minimap2和centrifuge这两个软件。但是，有很大一部分文章是以这几个工具进行数据分析的，我们也做一下，最后进行一个比较吧！

# 构建参考数据库
last-1060/src/lastdb -uYASS -R01 microbialdb ncbi-16S.fasta
# 比对https://gigascience.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13742-016-0111-z#Sec12
last-1060/src/lastal -P 4 -q 1 -b 1 -Q 0 -a 1 -e 45 microbialdb cleaned.fastq > aligned.maf
# 转换成BLAST格式
last-1060/scripts/maf-convert blasttab aligned.maf > aligned.txt

2）blast/diamond比对

这个过程参考自公众号基因学苑的nanopore数据分析培训班讲义。

#w使用seqkit先转fasta
seqkit fq2fa reads.scrubb.fq > query.fasta
#建立索引，如果已经建好了，可以跳过此步骤
makeblastdb -in ncbi-16S.fasta -dbtype nucl -parse_seqids -out 16S
blastn -query query.fasta -db 16S -out blastn.out - outfmt 0 -evalue 1e-5
#利用 diamond 提高比对速度，注意 diamond 的索引与 blast 不同，需要重新建立 diamond 比对 的索引
diamond makedb --in ncbi-16S.fasta  -d 16s
diamond blastx -d  16s -q query.fasta -o output.blast -p 4

4.结果处理，获得物种丰度表

由于自己水平还不够写脚本从比对结果中获得物种注释，脚本基本上来自台湾的那个同仁的。确切的说应该还是对比对结果的数据结构不够熟悉，争取后面多熟悉些。为了实现使用他的脚本，对数据库的信息进行了一些小的提取操作，用我暂时用得比较顺手的python完成的。我已经把处理好的数据上传了百度云，直接使用的话可以略过。

————–我是分界线的开始———–

cat ncbi-16S.fasta | grep ">" > conv.txt #先获得序列名信息备用

dic_fa = {}
i = 0
with open('conv.txt') as f:
    for line in f:
        i += 1
        if line.strip() != '':
            ac_n = line.strip().split('|')[3]
            gi_n = line.strip().split('|')[1]
            dic_fa[ac_n] = ''
            dic_fa[ac_n] = [gi_n, line.strip()]
print(i)

j = 0
fout = open('info.txt', 'w')
with open('sequence.gb') as f1:
    for line in f1:
        if line[:7] == "VERSION":
            seq_name = line.strip().split('     ')[1].split('  ')[0]
        if '/db_xref="taxon:' in line:
            tax_id = line.strip().split('/db_xref="taxon:')[1].split('"')[0]
            if seq_name in dic_fa.keys():
                fout.write(dic_fa[seq_name][1] + '\t' + tax_id + '\n') #+ seq_name + '\n')
            seq_name = ''
            tax_id = ''
            j += 1
print(j)

fout.close()

————–我是分界线的结束———–

# 加载包，第一次看到这样的方式
suppressMessages(library(data.table))
suppressMessages(library(tidyverse))
# 设置文件位置
id_mapping_file <- "/Volumes/Data/Biodata/Nanopore-16S/info.txt"
blastOutputs <- "/Volumes/Data/Biodata/Nanopore-16S/aligned.txt"
#导入输入文件
id_mapping <- fread(id_mapping_file, header = FALSE, sep = "\t", stringsAsFactors = FALSE)
setkey(id_mapping, V1)

blastoutput <- fread(blastOutputs, header = FALSE, sep = "\t", stringsAsFactors = FALSE)
blastoutput_filtered <- blastoutput %>% 
  dplyr::filter(V3>=90 & V4>=700) %>% 
  group_by(V1) %>% 
  dplyr::filter(V3 == max(V3)) %>% 
  dplyr::filter(V12 == max(V12))
allreadsnum <- length(unique(blastoutput$V1))
readStats <- table(blastoutput_filtered$V2)
refseqIds <- names(readStats)
df <- data.frame(RefseqID = refseqIds, 
                 Lineage = NA, 
                 ReadsNum = NA, 
                 OrgName = NA, 
                 ReadsPerc = NA)
#循环获得信息
for (i in 1:length(refseqIds)) {
  refseqid <- refseqIds[i]
  tmp <- id_mapping[.(refseqid)]
  lineage <- tmp$V3
  orgname <- tmp$V4
  readnum <- readStats[refseqid]
  perc <- readnum*100/allreadsnum
  df$Lineage[i] <- lineage
  df$ReadsNum[i] <- readnum
  df$ReadsPerc[i] <- perc
  df$OrgName[i] <- orgname
}

taxonomy <- paste(df$Lineage, df$OrgName, sep="; ")
output_df <- data.frame(Taxonomy = taxonomy, ReadsNumber = df$ReadsNum)
output_df <- aggregate(output_df$ReadsNumber, 
                       by = list(Taxonomy=output_df$Taxonomy), 
                       FUN = sum)
colnames(output_df)[2] <- "ReadsNumber"
ReadPercentage <- output_df$ReadsNumber*100/allreadsnum
output_df <- cbind(output_df, ReadPercentage)
output_df <- output_df[order(output_df$ReadPercentage, decreasing = TRUE),]
#output <- paste0("tax_", sub("\\.\\/Alignment\\/", "", file))
write.table(output_df, 'out.txt', sep = "\t", row.names = FALSE, quote = FALSE)

最后，如果顺利，就是结果了：

#build 10min，这步可以不用进行，已经有构建好的文件 ncbi_16s
#./centrifuge-1.0.3-beta/centrifuge-build -p 4 --bmax 1342177280 --conversion-table info.txt \
#                 --taxonomy-tree /Volumes/LENOVO_imcdul/db/NCBI_tax/nodes.dmp --name-table /Volumes/LENOVO_imcdul/db/NCBI_tax/names.dmp \
#                reference.fasta  ncbi_16s
#注释
../Help/centrifuge/centrifuge  test.fq -x ../Help/ncbi_16s -p 4 -t -S log.txt
../Help/centrifuge/centrifuge-kreport -x  ../Help/ncbi_16s centrifuge_report.tsv > test.txt

试了下发现两者的差别还是比较大的，这意味着很大的不可靠性，如果有新的方法和思路，欢迎交流，共同进步。之前nano-ampliseq[2]的流程就是因为没仔细阅读脚本说明，没有充分准备好依赖条件和软件，导致没有结果，感谢有同仁指出！阅读原文是我修正了部分内容的那个流程，时间关系，没有跑一遍。

其他可用的流程还包括同仁提到的q2-ONT流程（我试用下来物种注释结果相当不理想，难道是85%聚类的原因），以及那篇综述提到的聚类方法，总的来说，分析方法还是不够成熟，还需要继续改进下去！

前面提到的几个文件的分享链接: https://pan.baidu.com/s/1FOp6kU2dB_37_Wi_mH2F0Q 提取码: 8gce