selective recognition of co-assemblesd thrombin aptamer and docetaxel on mesoporous silica nanoparticles agsinst tumor cell proliferation

Chem.Eur.J.2011,17,13170-13174

介孔二氧化硅纳米粒子上的凝血酶识体和多西紫杉醇组装体对抑制肿瘤细胞扩散的选择性识别

关键词：抗肿瘤药物，识体，组装，药物输送，脂质体

通常，肿瘤的发生需要一定的物质、能量、细胞外基质和细胞内的信号传导。理想的癌症治疗方法是切断肿瘤细胞和细胞外基质间的链接，抑制细胞活性。两种或更多种治疗方法结合在一起可以协同抑制肿瘤细胞，同样也是治疗癌症的好方法。

最近的研究主要集中在特殊载体的研制上。这些载体能够包裹传统化学治疗药物，且可以通过一定的刺激释放药物，这些载体有与肿瘤相关的识体，能够选择性识别肿瘤相关的或肿瘤特异的抗原。研究发现，纳米载体能够通过增强渗透和保留作用延长循环时间并选择性地与癌组织结合。尤其重要的是，这些纳米载体的大小，与单分子相比，允许它们提供较大的药物有效载荷并可实现更高的靶向特异性。人们已经合成或分离出了很多样式的可用于治疗癌症的靶向分子，包括多肽、低聚糖以及人的抗体。有趣的是，核酸识体又称为核酸识体，被作为可应用在治疗和诊断上的新型靶向分子得以发展。核酸识体是单链的DNA或RNA寡核苷酸能够通过分子内相互作用折叠成三维结构，具有高亲和力和特异性，可识别各种靶标。15-mer-TBA是第一个核酸识体，它能够与反平行的链折叠成椅式结构的分子内四聚体，可抑制凝血酶的酶功能。凝血酶显著的肿瘤生物学效应包括凝血依赖机制和蛋白酶激活受体-1相关的信令；这会导致一些肿瘤的功能，特别是增殖和血管生成。据我们所知，尽管很多人对TBA构造生物传感器、分子机器和抗凝进行了广泛的研究，但利用TBA作用凝血酶，通过抑制凝血酶独特的蛋白分解能力以及进一步打破相关的信号转导通路来抑制肿瘤细胞的生长的研究却很少。

本文中，我们介绍一种TBA-lipid-MSN混合动力作为一种细胞外和细胞内抗癌纳米载体。一种有效的抗癌药物—多西他赛被合并到这个混合动力体系中。通过图1所示的自组装转运平台来说明选择性识别和药物释放。简单地讲，将改性的凝血酶核酸识体，5’-GGTTG GTGTG GTTGG AAAAA AAAAA AAAAA-C₁₈-spacer-3’(TBA A₁₅-C₁₈)组装到氢化大豆卵磷脂（HSPC）,mPEG2000-DSPE 和多西他赛的混合脂质囊泡上。囊泡利用碱催化的溶胶-凝胶法被分散在介孔二氧化硅纳米粒子外表面上。介绍介孔二氧化硅纳米粒子核有利于提高核酸识体和脂质体组合体的机械稳定性。最后的成分是1 mg TBA A₁₅-lipid-Dtxl-MSN (3 nmol Dtxl, 0.44 nmol TBA A₁₅)。将TBA A₁₅-lipid-Dtxl-MSN和HeLa 细胞以及凝血酶共培养，自组装的生物偶联物不但可以通过核酸识体特异性抗凝血酶的特点扰乱蛋白酶激活受体-1信号来抑制细胞在细胞外基质中的生长，而且由于Dtxl的存在能提高细胞质中的细胞毒性水平。

用扫描电镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）检查TBA A₁₅-lipid-Dtxl-MSN生物偶联物的自组装情况。短棒状单分散的MSNs的直径为100-200 nm，高宽比为2，如图S1中A所示。插图显示了典型的由一系列平行管道构成的多孔结构.图S1中B显示的是核酸适体-磷脂-Dtxl 囊泡的形态学特征。囊泡的平均粒径是160 nm。参考Bayerl课题组的方法，温度超过脂质体相转变温度以上的条件下,将囊泡和MSNs 混合在磷酸盐缓冲液中，TBA A₁₅-lipid-Dtxl便可以覆盖在MSNs表面。另外，可通过激光扫描共聚焦显微镜来观察自组装体。图S2中B表示的是MSNs表面上的脂质层含有NBD-PE的成功自组体。图S2 B中的红点表示TAMRA标记的核酸适体与生物偶联物联结在一起。

为了确定生物偶联物是否能够进入肿瘤细胞以及阐明复合体在细胞内的分布，将TBA A₁₅-lipid-MSN（1 mg mL^-1）,凝血酶（0.5 U mL^-1）,HeLa细胞在37℃下共培养40 min。去除质膜外的自由粒子，然后将新鲜的生长培养基加到CLSM上，以便于观测。如图1 A所示，将 marker Hoechst33342和细胞核共染色。图1 中B,C通过H双荧光通道实验证明HeLa细胞对生物偶联物的有效内吞能力。图1D中红绿通道的重叠的图像结果暗示生物偶联物在细胞质内分开了。图1E 是相关的传输模式。图1F中 3D CLSM图像是纳米载体内吞作用的直接证据。此外，我们用标准的MTT 方法检测了docetaxel胶囊化的TBA A_15­-lipid-MSN生物偶联物对HeLa细胞的细胞毒性效应。选择HeLa 细胞系的原因是它能够表达大量的细胞表面PAR-1，细胞表面PAR-1能够被凝血酶激活来加速肿瘤细胞的增值。

0.5UmL^-1 是可导致最大肿瘤细胞增生效果的最大凝血酶浓度。细胞活力的检测结果如图2所示。细胞与0.5UmL^-1 的凝血酶共培养组（第2组）作为阴性对照组，也就是说该组570 nm 波长下MTT-formazan的吸光度即为100% 细胞活力的吸光度。与对照组相比，单纯的HeLa 细胞，经过96个小时的孵化后细胞活性降低了30%。这个结果说明凝血酶对肿瘤增生有促进作用。细胞与0.5UmL^-1 的凝血酶和 1 mg mL^-1 的lipid-MSN 共培养96小时后，相比较对照组而言，有8%的细胞死亡。这表明lipid-MSN对细胞增生没有作用。实验组4和6中，凝血酶/TBA A₁₅ 的浓度比值为1:8。如实验组4的结果所示，存在TBA A₁₅-lipid-MSN 生物凝聚体时，25%的细胞死亡。这个结果与实验组1的很接近。实验结果表明，生物偶联物中的核酸适体对凝血酶的选择性识别可能会竞争性干扰凝血酶和TBA A­­₁₅ 的结合，导致细胞增生的中和。而且，与实验组5的结果对比，实验组6中细胞的活性为29%，这个结果表明细胞摄取docetaxel包裹的加入聚乙二醇的TBA A₁₅-lipid-MSN 生物偶联物和并在细胞内释放docetaxel。这个结果是一个显著的综合抗癌实验效果。为达到长期的同样治疗效果，给以lipid-Dtxl-MSN治疗系统时，低剂量的Dtxl更是不可或缺的。并且，这些实验结果表明，综合治疗策略可减少单一药物的剂量，减轻相关的副作用。

为了初步证实细胞外基质中混合体系和肿瘤细胞间的相互作用，我们对重要组成成分进行了分析。图3A 显示两种未结合的凝血酶结合识体可以在钾离子存在下形成一个椅式分子内G-四重折叠结构。另外，为了说明生物偶联物里面的自组装识体和凝血酶的相互作用会抑制凝血酶活性，我们研究了凝血酶将纤维蛋白原单体转变为不溶性纤维凝块的过程，如图3 B所示。通过观察浊度随时间的改变可以很容易观察相关的凝结物。实验结果表明，TBA A₁₅ 可以显著的抑制凝块，因为其相应的延迟时间与无抑制系统（lipid-MSN）相比增加了575%。这表明，生物偶联物里自组装识体对凝血酶的特异性选择阻碍了凝血酶与纤维蛋白的酶活性位点。而且，我们设计了体外细胞活性分析实验来检测无粘结的TBA A­₁₅ 对凝血酶促进HeLa细胞生长作用能力影响，如图3 C所示。作为没有入侵能力的分化良好的乳腺癌细胞株，选择MCF-7作为对照细胞系是因为它表达PAR-1的量很少。HeLa和MCF-7细胞系细胞活性的显著性差异结果表明TBA A₁₅ 对肿瘤细胞增生的抑制与干扰PAR-1信号接收转导有关。光谱和细胞实验结果可以用来检测和支持识体对凝血酶抑制能力，这种抑制与肿瘤致癌潜力有关。我们推测通过使用纳米载体物质，当PAR-1被过度表达时，TBA可以作为一种潜在的抗癌药物来使用。

下面我们介绍一个自组装生物偶联物和HeLa细胞相互作用过程的模型。在细胞基质中，组装在生物偶联物上的TBA A₁₅特异性结合凝血酶，其中TBA A₁₅会竞争性干扰凝血酶和PAR-1的相互作用，这种竞争性干扰可抑制肿瘤细胞。一旦被提起组装在脂质层上的Dtxl被摄取到体内，这种传统的疏水性抗癌药会马上被释放到细胞质中，在细胞质内引发细胞产生毒性。我们认为TBA A_15­-lipid-MSN生物偶联物不但可以抑制癌细胞的生长和血管生成，而且可以靶向运输抗癌药物。

总之，我们展示了凝血酶识体的选择性识别和一种传统的自组装在MSNs上的化学治疗药物，并利用它抑制肿瘤细胞的增生。我们已经证实改良的TBA和相关的混合组装体是一种有效的凝血酶靶向药剂，可抑制特异的肿瘤细胞生长。我们验证了生物偶联物在细胞质和细胞外基质中的功效。当PAR-1表达过量时这个混合系统结构可以用来系统地治疗癌症并且可以缓解治疗时因为摄入高剂量药物造成的副作用。

实验部分

材料：

所有的寡核苷酸均由北京AuGCT生物技术有限公司合成。两段没有结合凝血酶联接识体的序列为5’-GGTTG GTGTG GTTGG-3’(TBA) 和 5’-GGTTG GTGTG GTTGG AAAAA AAAAA  AAAAA-3’(TBA A₁₅)。CLSM中自组装生物偶联物中修饰的凝血酶识体是5’-TAMRA-GGTTG GTGTG GTTGG AAAAA AAAAA AAAAA-C₁₈-spacer-3’。细胞培养中自组装生物偶联物中修饰的凝血酶识体是5’-GGTTG GTGTG GTTGG AAAAA AAAAA AAAAA-C₁₈-spacer-3’。实验中用到的缓冲液，没有特殊标明，均为pH为7.4的PBS溶液。HSPC（纯度不低于99.0%）、mPEG2000-DSPE（纯度不低于99.0%）购买于日本Nippon Fine Chemical有限公司。凝血酶购买于中国北京Solarbio Science & Technology有限公司。

含有和不含有docetaxel混合脂质层的准备：

混合脂质层的制备参考曹等人的方法。