我们用钙黄绿素对斑马鱼骨质染色，可以让矿化的斑马鱼骨质发绿色荧光，因此可以通过荧光强度对斑马鱼骨质进行半定量分析。

1. 首先完成成骨染色（11dpf后的斑马鱼染色效果较好），在荧光显微镜下摄取图像。
   

2.在imageJ中打开图片，image>color>split channels，选择绿色通道进行分析。

3.将图片反相，Edit>Invert（快捷键Ctrl+Shift+I）。

4.选择需要测量的项目，Analyze>set measurements，勾选Area、mean gray value standard deviation、Integrated density和limit to threshold，点击OK。

5.选择适宜的阈值算法，image>Adjust>Auto Threshold>Method> try all>OK。

不同样本的比较要在同一摄取参数下获取图像（算法最好选最适宜的算法自动框选），比较后我决定选择default算法。

6.用矩形工具框选所要测量的4/5/6节骨头，image>Adjust>Threshold（快捷键Ctrl+Shift+T），选择default算法，Auto自动选择。

确保所需要测量的骨质都在矩形框内，并且没有框入其他杂光，测量Analyze>measure（快捷键Ctrl+M）。

其中area为框选的面积，Mean表示平均荧光强度，IntDen为所圈面积下的总光密度值（IOD）。

成骨染色方法以及骨分节参考文献：

Du SJ, Frenkel V, Kindschi G, Zohar Y. Visualizing normal and defective bone development in zebrafish embryos using the fluorescent chromophore calcein. Dev Biol. 2001;238(2):239-246. doi:10.1006/dbio.2001.0390