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2014年诺贝尔化学奖-超分辨光学成像小谈 精选

已有 20629 次阅读 2014-10-13 23:09 |系统分类:观点评述| 诺贝尔奖, 超分辨成像光学

本人2009年有幸参与一个973项目申报,内容就是发展超分辨光学成像研究蛋白质组学,但是最终没有成功,不过对超分辨光学成像知识略知一二了。

1.何谓超分辨:

      首先需准确理解超分辨的靶子,即谁被了,正确的理解应是--“远场光学分辨率被超了。赶超远场分辨率的方法有个途径:远场超分辨光学成像(此次诺贝尔化学奖);近场超分辨光学成像。这两种超分辨的思维与方法是截然不同的。

   1873年,德国科学家阿贝(Abbe)根据衍射理论首次推导出远场衍射分辨极限(阿贝提出的空间频谱的概念,为日后显微镜发展奠定坚实的基础,其中荷兰科学家泽尼克基于该思想发明了相差显微镜,获得1953年诺贝尔物理学奖)。远场衍射极限是指一个理想点物经光学系统成像,由于衍射的限制,不可能得到理想像点,而是得到一个夫琅和费衍射像,夫琅和费衍射零级斑就是所谓的艾里斑。这样每个物点的像就是一个弥散斑,两个弥散斑靠近后就不好区分,这样就限制了系统的分辨率,斑越大,分辨率越低。在此基础上产生了瑞利判据,即两个物点至少应相距多远,光学仪器才能够把它们分辨开:如果一个物点衍射图样的中央主极大与另一个物点衍射图样的中央主极大傍的第一极小(第一级暗纹)重合时,就认为这两个物点是恰可分辨的。

2. 远场超分辨成像

   根据瑞利判据,可得知远场显微镜的分辨率为0.61×波长/数值孔径nsin啊,则提高分辨率不外两种方法:其一,尽可能选择短的照明波长,如紫外光、x射线、电子等;其二,提高数值孔径。因此正常的光学分辨率极限约为200nm,这个分辨率目前是不能满足人们对微观世界的认识,所以产生了透射电子显微镜,本质是利用物质波理论,减少波长。

2.1 经典的超分辨---多光子吸收超分辨

     一般圆形光斑的光强分布是高斯型的,中间光强大,即光子密度高。若荧光产生过程是多光子吸收过程,则可激发出荧光的光斑区只能是中间的大光强区,此时简单有效的实现了超分辨荧光成像,最终通过扫描获得超分辨图像。该方法优点是激发光源是长波长光,光毒性小,穿透能力强,不过容易造成热损伤。目前最成功的应用是双光子扫描荧光显微镜(注意不是双光子扫描共聚焦显微镜),主要应用在脑部神经活动研究,因为较好的穿透深度。

2.2  我最喜欢的超分辨--受激发射损耗显微技术(Stimulated Emission Depletion, STED

     该成像理论源于爱因斯坦的受激辐射理论,Stefan Hell创造性把该理论应用于荧光成像,最终做出了成像系统。简单的说STED是利用激发光使基态粒子跃迁到激发态,随后用整形后STED环形光照射样品,引起受激辐射,消耗了激发态粒子数,导致焦斑周边上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子能力,而剩下的可发射荧光区域被限制在小于衍射极限区域内,获得一个小于衍射极限的荧光发光点,再通过扫描可获得超分辨率的图像。2003年,Hell研究组获得28 nm的横向分辨率。

   该方法是最物理的超分辨光学方法,创造性的运用爱因斯受激辐射理论,据说当时投OL时候差点被拒,审稿人觉得太扯。个人觉得STED最有发展前景,因为最有希望做实时、活体成像的(光学成像在生物上应用核心的优点就是活体+实时+可视,这是电镜等方法无法比拟的),目前Hell已经实现了视频级的成像速度,但还有很大提升空间,达人们可以继续努力加油了。

2.3  PhotoActivated Localization microscopy, PALMBetzig,诺奖);Stochastic Optical Reconstruction Microscopy STORM(庄小威);Fluorescence PhotoActivation Localization microscopy, FPALMSamuel Hess

物点成像由于衍射极限形成艾里斑,导致有200nm分辨率极限。但是发散思维想想,要是能把艾里斑变小,即半高宽变瘦,就可以突破200nm的限制了。如何把艾里斑变小呢,理论表明对于荧光分子定位分析只要有足够的光子数被接收,计算分析荧光激发光子光强分布的中心可以实现高精度的粒子定位,最终实现超分辨成像。理论表明该方法可以实现最小1nm的分辨率。

这三个方法异曲同工,基于“光子可控开关的荧光探针”(这个技术出现很关键,否则该三种方法无法实现)和“质心定位原理”,在双激光(一个负责活化荧光分子,一个负责激发荧光)激发下荧光探针随机发光,大量重复曝光收集多的荧光分子数,再通过分子定位和分子位置“重构”形成超高分辨率的图像。需要指出的是该方法基于宽场成像方法,不需要扫描。该三种方法虽然可以提供更高的空间分辨率,但成像时间往往需要十几分钟(因为要大量重复曝光),以时间换空间,无法满足快时程的实时可视的成像。

这种超分辨成像是可以说是算出来的,不像Hell方法那么物理。目前这三种超分辨成像的瓶颈已经不是算法什么了,而是探针本身了,即如何制造出更小的可控开关的荧光探针(如1nm的。。。。),化学家加油了。

2.4  结构光照明显微技术,Structured Ilunination Microscopy, SIMMats Gustafsson

    是一种宽场成像方法,荧光分子在高强度激光照射下产生饱和吸收,通过求解图案中的高频信息获得样品的纳米分辨图像,已经实现了几十纳米的横向空间分辨率。

3. 远场超分辨发展简史

1994年,Stefan HellOL上发表STED理论。

2000年,Mats Gustafsson研究了机构化照明显微镜(structured-illuminationmicroscopy, SIM)。

2006年,Lippincott-SchwartzBetzig等在《science》上发表了他们的PALM方法,使用它里给细胞黏着斑和特定细胞器的蛋白质成像。

2006年,Samuel Hess等在《Biophysical Journal》发表Fluorescence photoactivationlocalization microscopy, FPALM

2006年,庄小威等在《nature method》发表随机光重建显微镜(stochastic opticalreconstruction microscopy STORM),并使用它以20纳米的分辨率观测DNA DNA蛋白质复合体

2008年,Hell的小组在nature杂志报道使用 STED方法视频展示活神经元里突触泡的活动,与标记抗体有关的蛋白质。

 

4. 近场超分辨

   近场成像主要是倏逝场探测,倏逝场不服从瑞利判据,它们能够在远小于波长的距离上显示局部的强烈变化,通过采用一个小的有限的纳米孔径或者无孔径探针探测倏逝场,为了产生二维图象,沿物体表面进行扫描,由所得到的探测数据重构图象。原子力显微镜,扫描隧道显微镜也是沿物体表面进行扫描得到的探测数据,再重构图象。这种方法类似盲人摸象,不是看见的,是亲密接触“感觉”出来的。




2014年诺贝尔奖
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