实验目的：从粪便中分离提取外泌体。

实验原料：粪便（新鲜或者4℃存储样品）

试剂耗材：

1，外泌体提取试剂盒（Umibio，UR52121）

2，针式过滤器(0.45μm)

3，PBS缓冲液（2℃-8℃预冷）

实验步骤：

一、         样品预处理

（1）粪便样本收集在无菌的宽口容器中，立即使用（收集样品后置于冰上）或冷藏(4°C)。

（2）使用勺子将3g的粪便转移到预先称重的离心管中，向试管中加入预冷(2℃-8℃)的30毫升无内毒素PBS（按照每1g粪便对应10毫升PBS加入）。

（3）通过涡旋振荡器充分混匀粪便样本5分钟。在此步骤中，将高速离心机和离心转子冷却至4°C。

（4）将混匀粪便的离心管放入高速离心机中，在4°C，8000g的温度下离心10分钟。

（5）收集滤过液，使用移液器将其转移到新的离心管中，在4°C，10000g的温度下离心10分钟。

（6）收集滤过液，通过针式过滤器(0.45μm)进行过滤，收集滤过液。

二、         提取外泌体

（1）滤过液预处理：在去除杂质的离心滤过液中加入Exosome Concentration Solution（ECS试剂），具体的加入剂量如下：（其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算）

（2）溶液混合：加入ECS试剂后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀1 min，再放置于4℃静置至少2 h；（增加静置时间可提高外泌体得率，但静置时间不可超过24h）

（3）沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于4℃以10000 g离心60 min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；（注：尽可能吸净滤过液）

（4）外泌体重悬：取1×PBS均匀吹打离心沉淀物（具体加入剂量如下表），待其溶解后，将重悬液转移至新的1.5 mL离心管中；

注：其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算

（5）收获外泌体颗粒：将含有重悬液的1.5 mL离心管于4℃以12000 g离心2 min，保留滤过液，该滤过液中富含外泌体颗粒。（注：若沉淀较多，可12000 g /2min离心多次至无明显沉淀，每次取离心滤过液）

三、         纯化外泌体

（1）纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入Exosome Purification Filter（EPF柱）上室中，于4℃以3000 g离心10 min，离心后收集EPF柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒；（注：EPF柱不可重复使用）

（2）外泌体的保存：纯化后的外泌体以50-100 μL进行分装保存于-80℃低温冰箱中，以备后继实验使用。

参考文献：

1, Isolation and Characterization of Exosomes from Mouse Feces, Bio Protoc. 2020 Apr 20;10(8):e3584. doi: 10.21769/bioprotoc.3584.

2, High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nat Commun. 2021 Jan 11;12(1):213. doi: 10.1038/s41467-020-20500-w.

3, Sepsis-Like Systemic Inflammation Induced by Nano-Sized Extracellular Vesicles From Feces. Front Microbiol. 2018 Aug 7;9:1735. doi: 10.3389/fmicb.2018.01735. eCollection 2018.