O2k能量代谢测量仪的实验材料制备方案

——小鼠心脏线粒体提取办法

1、准备工作

打开离心机，将离心机运转至低温4℃并保持温度。确保所有试剂缓冲液、实验解剖工具、组织匀浆工具以及离心机转子等均维持在4℃（或者在足够的冰上操作）

1.1小鼠处死办法

用颈脱位法处死实验用小鼠

1.2线粒体提取流程

a)   实验解剖，取出小鼠心脏部位，去除多余的血管结构、结缔组织以及脂肪组织等，将处理好的心脏器官立刻放入BIOPS缓冲液中，整个过程在4℃环境（或冰上）进行

b)   在4℃条件下，将心脏器官放入有盖培养皿中，根据实验需要，单独提取左心室或者使用整个心脏；操作者需小心去除血液凝块等组织。将处理好的心脏放入10ml的玻璃烧杯中，加入1ml 4℃ BIOPS缓冲液（见2.1），取低温剪刀，将实验心脏组织剪碎至小块

c)   将组织碎块放入10ml手动玻璃研磨器中，加入2ml线粒体缓冲液B（见2.3），匀速手动研磨6-8次，形成心脏组织匀浆液

d)   将心脏组织匀浆液放入50ml离心管中，再加入3ml线粒体缓冲液B

e)   将上述液体在4℃、800g的条件下离心10min

f)   取出上清液，重新放置于新的50ml离心管中

g)   将该上清液再次在4℃、10000g条件下离心10min

h)   移除上清液，保留线粒体沉淀

i)   用500微升线粒体缓冲液A（见2.2）再次悬浮线粒体沉淀，然后，用线粒体缓冲液A将液体定容至2ml，形成线粒体悬浮液

j)   将线粒体悬浮液在4℃、10000g的条件下离心10min，保留沉淀

k)   用悬浮缓冲液（见2.4）再次悬浮线粒体沉淀，定容至200微升

l)   取5微升线粒体悬浮液直接加入O2k能量代谢测量仪的仓室中，用于线粒体呼吸能力的测量

m)   将剩余的线粒体悬浮液进行分装，每20微升放入一个离心管，零下20℃保存，用于后续的分析（蛋白浓度定量等）

2.试剂

2.1 BIOPS器官组织缓冲液

常见于组织器官等实验材料的缓冲液，详细内容可咨询工作人员

2.2线粒体缓冲液A

2.3 线粒体缓冲液B

在10ml线粒体缓冲液A中加入5mg subtilisin

2.4 悬浮缓冲液

不带有BSA的线粒体缓冲液A

3.参考文献

1.Mela L , Seitz S (1979)Isolation of mitochondria with emphasis on heart mitochondria from small amounts of tissue.Methods Enzymol 55:39-46

2.Fontana-Ayoub M, Fasching M, Gnaiger E (2016) Selected media and chemicals for respirometry with mitochondrial preparations. Mitochondr Physiol Network 03.02(18):1-10.